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SARS-CoV-2广谱中和抗体性质鉴定

2024-04-23 9 上传者：管理员

摘要：目的：对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)广谱中和抗体XMA09进行性质鉴定，探究其广谱中和突变株的潜在机制，为SARS-CoV-2的疫苗设计与广谱中和抗体筛选提供参考。方法：通过ExpiCHO真核表达系统与Protein A层析柱表达纯化XMA09蛋白；冷冻电镜技术确定XMA09识别的受体结构域（RBD）上的关键氨基酸位点；间接ELISA与表面等离子共振（SPR）技术检测XMA09对SARS-CoV-2及其突变株Spike蛋白的亲和力；采用基于水疱性口炎病毒（VSV）的假病毒系统检测XMA09对SARS-CoV-2野生型及突变株的中和能力。结果：本研究发现XMA09识别的表位较为保守，对多种突变株Spike蛋白均具有强结合能力，能广谱中和关切突变株（VOCs），包括广泛流行的Omicron亚突变株BA.4/5。结论：XMA09是SARS-CoV-2广谱中和抗体，具有作为SARS-CoV-2治疗性抗体的潜力，并可为SARS-CoV-2的广谱疫苗设计与抗体药物开发提供参考意义。

关键词：
SARS-CoV-2
单股正链RNA病毒
受体结合结构域(RBD)
呼吸综合征
广谱中和抗体
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严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2）是一种有包膜的单股正链RNA病毒，其表面有4种结构蛋白，分别是小包膜（envelope,E）蛋白、表面刺突（spike,S）蛋白、核（nucleocapsid,N）蛋白和囊膜（membrance,M）蛋白。病毒通过S蛋白上的受体结合结构域（receptor-binding domain,RBD）与宿主细胞上的血管紧张素转换酶2(angiotensin-coverting enzyme 2,ACE2）的结合介导病毒进入并感染细胞[1]。S蛋白成为疫苗及抗体类药物研发的主要靶蛋白，中和抗体主要通过靶向结合RBD蛋白从而降低或完全阻断病毒感染[2]。SARS-CoV-2作为RNA病毒，在其复制过程中容易发生基因突变，并演变出了一系列变异株。目前已报道的SARS-CoV-2关切变异株（variants of concern,VOCs）包括Alpha、Beta、Gamma、Delta以及Omicron[3]。这些VOCs具有更强的传播能力以及毒力，甚至不同程度地逃逸由病毒感染或接种疫苗激发的体液免疫保护。Omicron突变株是SARS-CoV-2新型突变株，其S蛋白存在超过30处的氨基酸突变，其中有15处位于RBD[4,5]。Omicron是目前S蛋白累积突变数量最多的毒株，其传播能力与免疫逃逸能力明显优于其他突变株，因而迅速成为SARS-CoV-2的优势突变株[6]。同时，Omicron突变株不断衍生出多种亚突变株，其中BA.4与BA.5相较于BA.2具有更强的传播优势，有研究报道其可逃逸三针免疫或BA.1突破性感染的疫苗接种者血清中的中和抗体保护[7]。SARS-CoV-2突变株的出现，尤其是Omicron使得现有的获批抗体，如LY-CoV016、LY-CoV555、REGN10987等的中和效力显著下降，这对基于野生型的疫苗和抗体类药物的有效性提出了严峻的挑战[8,9,10]。本研究对筛选获得的广谱中和抗体进行了表位特征分析，验证了其广谱中和能力的亲和力基础，系统探究了其广谱中和的潜在机制，旨在为SARS-CoV-2的疫苗设计与广谱中和抗体药物的开发提供理论依据[11]。

1、材料与方法

1.1材料

大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli) DH5α菌株为本实验室保存；质粒小提试剂盒购自天根生化科技公司；ExpiCHO悬浮细胞及其培养基、转染试剂盒均购自赛默飞世尔科技有限公司；SARS-CoV-2野生型S蛋白购自百普赛斯生物科技公司，其突变株S蛋白购自北京义翘神州科技有限公司；Protein A层析柱与CM5芯片均购自Cytiva公司；洋地黄皂苷购自Sigma公司；封闭液-3与ED13稀释液购于北京万泰生物药业股份有限公司。

1.2方法

1.2.1单克隆抗体的表达与纯化

将抗体轻重链基因序列优化后，连接至含有人IgG1轻重链恒定区的pTT5载体中，委托通用生物公司合成表达质粒。将质粒转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞后，挑取单克隆菌落接种于氨苄青霉素抗性（1∶1 000）的LB培养基中进行扩大培养，按照质粒小量提取试剂盒说明书提取质粒。之后参考ExpiCHO表达系统试剂盒说明书，将配对的抗体轻重链质粒共转染到ExpiCHO悬浮细胞中，于32℃摇床中悬浮培养14 d,4 000 r/min离心10 min，收取上清，0.22µm滤膜过滤，Protein A层析介质纯化蛋白，纯化后于4℃透析至10 mmol/L PBS(137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4·12H2O、1.76 mmol/L KH2PO4,pH=7.4）中，经SDS-PAGE鉴定后使用。

1.2.2单克隆抗体识别RBD上的关键氨基酸位点

利用冷冻电镜技术确定抗体与SARS-CoV-2野生型RBD结合的关键氨基酸位点。在SARS-CoV-2野生型S蛋白与过量XMA09 Fab混合物中加入0.01%(v/v）洋地黄皂苷孵育，然后将样品放置于辉光放电(20 mA,60 s)处理后的Quantifoil多孔碳膜(R1.2/1.3,200目)上，将冷冻制样设备Vitrobot MarkⅣ条件设置为湿度100%、温度4℃，对样品进行冷冻处理。在FEI Tecnai F30透射电子显微镜上使用SerialEM软件获取数据，其操作电压为300 kV，并配备Gatan K3直接检测器。

1.2.3单克隆抗体结合活性检测

本研究采用间接ELISA法检测抗体与各突变株S蛋白的结合活性。采用50 mmol/L CB(35 mmol/L NaHCO3、15 mmol/L Na2CO3,pH=9.6）稀释SARS-CoV-2野生型及其突变株S蛋白，以100 ng/well (1µg/ml）包被96孔酶标板，置于37℃温箱孵育2 h,PBST(20 mmol/L,pH=7.4,150 mmol/L NaCl,0.1%Tween20）洗1遍后甩干，每孔加入200µl商品化封闭液-3,4℃过夜，甩干备用。将抗体用PBS梯度稀释后，加入包被有抗原的96孔酶标板中，37℃孵育30 min，用PBST洗涤5遍，甩干，HRP标记的山羊抗人IgG抗体用ED13稀释液按照1∶5 000稀释后以100µl/well加入酶标板中，孵育后洗涤同上。最后，与底物于37℃反应显色15 min后加入50µl 2 mol/L H2SO4终止反应，读取OD 450/630 nm值，OD 450/630 nm>3认定为完全饱和，OD 450/630 nm<0.1则为阴性，以浓度的常用对数为横坐标，OD 450/630 nm值为纵坐标，GraphPad Prism 7.0作图并采用4参数Logistic回归模型计算半数有效浓度（EC50）。

1.2.4单克隆抗体亲和力检测

在25℃下，通过Biacore 8k(GE Healthcare）仪器single-cycle模式，采用SPR技术检测抗体与突变株S蛋白的亲和力。首先按照氨基偶联程序，以过滤脱气处理的PBS为缓冲液，使用0.2 mol/L N-乙基-N-二甲基-氨丙基碳二亚胺（EDC）与0.05 mol/L N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)1∶1混合活化CM5芯片表面，用10 mmol/L pH=4.5的乙酸钠稀释SARS-CoV-2野生型及其部分突变株的S蛋白，使其分别偶联于CM5芯片不同通道的Flow cell 2上，最后使用1.0 mol/L pH=8.5的乙醇胺封闭多余的活性基团完成蛋白包被。参照single-cycle分析程序，梯度稀释抗体（400 nmol/L、200 nmol/L、100 nmol/L、50 nmol/L、25 nmol/L），以流速30µl/min进样检测通道与参比通道，使抗原与抗体反应120 s，最后一个浓度反应结束后，解离300 s，用10 mmol/L pH=1.5的甘氨酸再生芯片表面。使用Biacore Insight Evaluation Software在1∶1 binding拟合模型下空白校正，计算结合速率常数（Ka）、解离速率常数（Kd）以及亲和力（KD）。

1.2.5单克隆抗体中和能力检测

利用水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus,VSV）的假病毒系统检测单克隆抗体对SARS-CoV-2野生型及其突变株的中和能力[12]。将抗体梯度稀释后与一定浓度的假病毒（MOI=0.05）混合，并在37℃培养箱中孵育1h，抗体与假病毒的稀释均使用10%FBS-DMEM。孵育结束后，将抗体与病毒的混合物转移至BHK21-hACE2细胞（稳定表达人ACE2）的96孔板中，并将该板置于37℃培养箱中培养12 h。利用Opera phenix或者Operetta CLS (PerkinElmer）采集该板的荧光图像，随后通过Columbus image management软件进行定量分析。使用GraphPad Prism 7.0作图并采用4参数Logistic回归模型计算抗体的半数抑制浓度（IC50）。

2、结果

2.1单克隆抗体识别表位的保守性分析

XMA09是从SARS-CoV-2原始株感染的康复者体内筛选得到的广谱中和抗体，其结合位点位于RBD的腰部区域，远离ACE2受体结合的区域，属于Class 5类抗体[13]。XMA09靶向SARS-CoV-2野生型RBD的关键氨基酸位点如图1所示，包括Y396、P426、S469、S514、E516、L518等，避开了多数VOCs在RBD上发生的突变，如K417N、L452R、T478K、E484K、N501Y等。与此同时，XMA09结合RBD的关键氨基酸位点在Omicron亚突变株BA.4/5上仍未发生突变。综上所述，该抗体的结构信息解释了XMA09广谱中和SARS-CoV-2及其VOCs能力的来源：XMA09识别的氨基酸位点相对保守，其中和能力受到已有突变株的影响较小。

2.2单克隆抗体与各突变株S蛋白的亲和力

XMA09抗体对SARS-CoV-2野生型及其部分突变株S蛋白的结合活性与亲和力检测结果见图2，其对SARS-CoV-2 WT、Alpha、Beta、Gamma、Delta、BA.1与BA.4/5 S蛋白结合活性（EC50）分别为79 ng/ml、259 ng/ml、199 ng/ml、426 ng/ml、641 ng/ml、125 ng/ml、70 ng/ml。相较于原始株，XMA09对Alpha、Beta、Gamma以及Delta突变株的亲和力稍有下降，但仍能达到nmol/L级别，针对BA.1与BA.4/5的亲和力水平与原始株相当，处于pmol/L级别，均为强亲和力水平。

图1 SARS-CoV-2、VOCs、SARS-CoV Spike蛋白氨基酸序列以及XMA09识别的关键氨基酸位点

图2 XMA09对SARS-CoV-2、VOCs Spike蛋白的相对亲和力

图3 XMA09对各突变株假病毒的中和能力

2.3单克隆抗体针对各突变株的中和能力

XMA09对614G、Alpha、Beta、Gamma、Delta假病毒均有一定中和能力，IC50分别为18.31µg/ml、12.95µg/ml、19.21µg/ml、0.025µg/ml、17.25µg/ml，相较于614G,XMA09中和VOCs的能力无明显变化，甚至针对Gamma突变株的中和能力明显增强（>700倍）。除此之外，XMA09中和Omicron系列变体BA.1、BA.2.12.1与BA.4/5的能力也仅存在5倍以内的波动，其IC50为30.67µg/ml、78.25µg/ml与71.24µg/ml,XMA09还表现出交叉中和SARS-CoV假病毒的能力，IC50为0.35µg/ml，见图3。

3、讨论

目前，针对SARS-CoV-2感染的治疗方法中，被动免疫治疗主要依靠抗体进行，其中将非竞争性的抗体进行组合的鸡尾酒疗法在一定程度上可以增强治疗效果与抵抗未来突变株的能力。虽然有研究报道，相较于早期流行的突变株，Omicron感染者的住院率与重症率均有所下降，但由于Omicron突变株具有强大的免疫逃逸能力，可造成康复者与疫苗接种者的突破性感染[14]。Omicron庞大的感染数量仍旧对临床应用的治疗性抗体中和病毒的能力产生了很大的影响。由于Omicron及其亚型在S蛋白上普遍存在E484A、Q493R等氨基酸的突变，对这些位点突变敏感的REGN10933对Omicron系列的中和能力几乎完全丧失，AZD8895的中和能力也明显下降；即使AZD1061仍旧能够中和BA.2，但由于BA.1中的G446S与BA.1.1中的R346K，其对这两个亚型的中和能力下降显著，甚至完全丧失[15]。

本研究表达纯化了广谱中和抗体XMA09，并对其性质进行分析，发现其识别表位与之前报道的S2H97类似[13]，远离RBM区域，不直接阻断ACE2受体与S蛋白的结合，而这些关键氨基酸可能对维持病毒S蛋白的稳定性以及功能有着重要的作用，所以在Sarbecovirus的RBD上相对较为保守，这也促使XMA09对SARS-CoV-2各突变株的中和能力不受明显影响，并可交叉中和SARS-CoV。有研究表明此类抗体可能通过降低S蛋白的稳定性来抑制病毒感染，且通过过表达ACE2的细胞系进行的假病毒中和实验可能会低估此类中和抗体的中和能力[16,17,18,19]。在之前的结构解析中，仅能观察到XMA09与S蛋白单体的相互作用，并在中分辨率结构下观察到XMA09的结合可以引发与相邻N端结构域（N-terminal domain,NTD）的空间位阻冲突，这一现象提示XMA09中和病毒的可能机制在于其与RBD结合后，可破坏S蛋白三聚体稳定性，从而诱导S蛋白解离，达到抗病毒的效果，而在负染透射电镜下观察到与XMA09作用后的S蛋白三聚体解构现象也印证了此种猜想[11]。广谱中和抗体对于早期应急预防与治疗有着更为重要的意义，这提示或许可以通过糖基化遮蔽修饰等方式对免疫原再设计，对广谱识别表位进行免疫聚焦，以提高广谱中和抗体的占比，更好地应对不同突变株的出现。

XMA09来源于SARS-CoV-2感染康复者，为全人源抗体，无需进行人源化改造即可应用于临床，这表明广谱抗体XMA09存在作为治疗SARS-CoV-2感染候选抗体的潜力，或许可与现存识别其他表位的治疗性抗体进行组合或改造来应对不断突变的SARS-CoV-2病毒。例如将XMA09与受到一定影响的治疗性抗体改造为双特异性抗体，利用XMA09广谱高亲和力的特性促进该抗体与S蛋白的结合，以恢复甚至通过新的中和机制提高其抗病毒能力[18,20,21,22]。当然，随着SARS-CoV-2的不断进化，考虑到筛选新抗体的投入成本与结果的不确定性，迫切需要新的策略来优化现有抗体的抗病毒效果。因此，未来的工作重点应倾向于提高现存有效抗体的中和广度与效价。

参考文献:

[1]何晓波,虞淦军,吴艳峰.新型冠状病毒突变株对传染性和疾病进展及免疫保护影响的研究进展[J].中国免疫学杂志,2021,37(16):2021-2028.

基金资助:国家自然科学基金项目(82071783);

文章来源:陈秀婷,汪毅祯,商慧娴,等.SARS-CoV-2广谱中和抗体性质鉴定[J].中国免疫学杂志,2024,40(04):693-697.