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基质金属蛋白酶-13在多发性骨髓瘤中的作用研究

2024-12-02 124 上传者：管理员

摘要：目的：探讨基质金属蛋白酶-13(MMP-13)在多发性骨髓瘤（MM）疾病发生发展及病情判断、预后评估等方面的作用。方法：收集MM患者57例、正常对照人群45例，采用实时荧光定量PCR检测研究对象MMP-13基因m RNA表达水平，比较MM患者组和正常对照组MMP-13 m RNA表达水平的差异，分析MMP-13与MM骨病及其严重程度、ISS分期、DS分期及治疗效果的关系。结果：MM患者MMP-13 m RNA表达水平较正常对照组显著升高（P<0.05）；有骨病的MM患者较无骨病的患者MMP-13 m RNA明显升高，且骨病越严重升高越明显（P<0.05）;ISS分期及DS分期Ⅰ期与Ⅲ期患者之间MMP-13 m RNA差异也有统计学意义（P<0.05）；患者治疗后较治疗前MMP-13明显下降（P<0.05）。结论：MMP-13基因m RNA表达水平与MM发生发展相关，其表达水平在病情判断、预后评估等方面具有一定的指导意义。

关键词：
MMP-13
多发性骨髓瘤
浆细胞
血液系统
骨髓瘤骨病
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多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是一种浆细胞性的血液系统恶性肿瘤，属于B细胞恶性肿瘤，其特征是血液浆细胞的克隆性增殖和单克隆免疫球蛋白过量表达。MM发病率在血液系统恶性肿瘤中高居第2位，占血液系统恶性肿瘤死亡人数的15%-20%，占所有肿瘤的1%[1-3]。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）是具有蛋白溶解酶活性的锌依赖性内肽酶家族，研究发现，多种MMP成员参与了破骨细胞活化、溶骨性骨质破坏及骨髓基质细胞引起的细胞外基质重建，促进骨髓瘤骨病发展[4-5]。MMP-13是MMP家族重要成员，可降解多种细胞外基质，与骨质重吸收、肿瘤浸润和转移等过程存在关联[6]。本研究采用实时荧光定量PCR法检测MM患者MMP-13基因m RNA表达水平，分析MMP-13基因表达水平与MM骨病严重程度、ISS临床分期及治疗前后临床指标的关系，探讨MMP-13基因在MM发生发展及病情判断、预后评估等方面的作用。

1、材料和方法

病例资料

收集2018至2020年间由新疆维吾尔自治区人民医院收治的MM患者57例，以在本院体检中心进行健康体检人员45人作为对照组。MM诊断标准采用《中国多发性骨髓瘤诊治指南（2017年修订）》[7]并按2015年3月美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network）发布的国际分期标准（ISS)[8]和DS(Durie-Salmon）分期标准[9]进行分期。排除其他急慢性感染、肿瘤及自身免疫性疾病。本研究经本院伦理委员会批准（批准号：KY2019051521），受试者均知情同意。

标本采集

采集MM患者和正常对照者的空腹静脉血各3 ml，立即转移至含EDTA抗凝剂的紫头管和无抗凝剂的红头管里，颠倒混匀7-8次。紫头管样本分为两份，其中一份在1 h内做完全血细胞及五分类计数，另一份1 791×g离心15 min，分离血浆后置于-80℃冰箱冻存备用，其余血细胞进行白细胞样本收集。红头管室温静置30 min后1 791×g离心15 min，分离血清后置于-80℃冰箱冻存备用。

试剂与仪器

PCR试剂、RNA提取及反转录试剂盒均购自美国Applied Biological Materials公司。高速冷冻离心机（上海力申科学仪器有限公司），漩涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），Nano-100微量分光光度计（杭州奥盛仪器公司），电泳仪（北京百晶生物技术有限公司），凝胶成像系统（上海天能公司），PCR仪（美国Bio-Rad公司），实时PCR仪（美国ABI公司）。

总RNA的提取及逆转录

采用5×All-In-One RT Master Mix (with Accu RT Genomic DNA Removal Kit)试剂盒提取细胞总RNA，微量分光光度计检测RNA的浓度和纯度，琼脂糖电泳检测RNA完整性，浓度低于10 ng/μl或A260/280比值过大或过小的样本将被弃用。将总RNA逆转录为cDNA，置于-80℃保存备用。

实时荧光定量PCR法检测MMP-13基因m RNA的表达情况

以c DNA为模板进行PCR扩增，严格按照试剂盒说明书操作。MMP-13基因上游引物为5′-AACGCCAG ACAAATGTGACC-3′，下游引物为5′-AGGTCATGAG AAGGGTGCTC-3′；以管家基因GAPDH作为内参，GAPDH上游引物为5′-TGTTGCCATCA ATGACCCCT T-3′，下游引物为5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′。PCR扩增参数：95℃10 min;95℃15 s,60℃60 s，共40个循环。采集检测数据，分析各组MMP-13基因m RNA表达水平。

统计学分析

用SPSS 19.0软件进行数据处理和分析，数据采用均值±标准差（±SD）表示，组间年龄差异比较采用t检验；组间性别差异比较采用χ2检验。用叠加值2-∆∆Ct代表某样本的MMP-13基因表达水平，其中∆∆Ct=∆CT(A)-∆CT(B)，∆CT(A)=CT(A)-CT(GAPDH)（公式中A为实验组，B为对照组）；各组平均值及差异用Wilcoxon-Mann-Whitney U检验。计算Pearson相关系数（正态分布资料）或Spearman相关系数（非正态分布资料）以分析MM患者MMP-13基因表达水平与疾病进展的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

MM患者临床基本资料分析

本研究严格按照诊断标准与排除标准纳入了57例MM患者，其中男性32例（56.14%），女性25例（43.86%），男女比例为1.28∶1，中位年龄65(33-83）岁；45例对照者中，男性24例（53.33%），女性21例（46.67%），男女比例为1.14∶1，中位年龄62(45-89）岁。57例患者的基本情况见表1。

MM患者与正常对照组MMP-13基因m RNA表达水平比较

与正常对照组比较，MM组MMP-13基因m RNA表达水平明显升高（1.931±1.237 vs 1.255±0.846），差异有显著统计学意义（Z=-2.642,P=0.008）（图1）。

MMP-13基因m RNA表达水平与MM骨病及其严重程度间的关系

根据骨病严重程度对MM患者进行分级，将骨病0级的患者纳入无骨病组，骨病1-4级的患者纳入有骨病组，比较两组患者之间MMP-13基因m RNA表达水平的差异，结果提示有骨病组MMP-13基因m RNA表达水平高于无骨病组，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。

比较骨病0-2级患者与骨病3-4级患者MMP-13基因m RNA表达水平，分析MMP-13与骨病严重程度的相关性，结果显示，骨病3-4级组MMP-13基因m RNA表达水平高于骨病0-2级组，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。

MM患者MMP-13基因m RNA表达水平与不同分期的关系

比较ISS分期Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期MM患者的MMP-13基因m RNA表达水平，发现Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期，Ⅰ期与Ⅲ期MMP-13基因m RNA表达水平差异有显著统计学意义（P<0.01）；Ⅰ期与Ⅱ期、Ⅱ期与Ⅲ期MMP-13基因m RNA表达水平差异均无统计学意义（P>0.05）（表3）。

比较DS分期Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期MM患者的MMP-13基因m RNA表达水平，发现Ⅰ期<Ⅲ期<Ⅱ期，Ⅰ期与Ⅱ期、Ⅲ期MMP-13基因m RNA表达水平差异均有统计学意义（P<0.05）；Ⅱ期与Ⅲ期MMP-13基因m RNA表达水平差异无统计学意义（P>0.05）（表3）。

MM患者治疗前和治疗后MMP-13基因m RNA表达水平的差异

分别于治疗前、第二个疗程结束后的第10天或第四个疗程结束后的第10天抽取患者空腹静脉血，检测MMP-13基因m RNA表达水平，比较治疗前和治疗后MMP-13基因m RNA表达水平的差异，结果显示，治疗后MMP-13基因m RNA表达水平低于治疗前，差异有统计学意义（P<0.05）（表4）。

MM患者MMP-13基因m RNA表达水平与疾病进展相关性分析

分析MM患者有无骨病与MMP-13基因m RNA表达水平间的关系，其相关系数r=0.312,P=0.018，具有正相关性，提示MM患者从无骨病发展到有骨病的同时MMP-13基因m RNA表达水平也随之升高；且随着骨病严重程度的增加，MMP-13基因m RNA表达水平也逐步增高（r=0.294,P=0.026）。MM患者ISS分期与MMP-13基因m RNA表达水平间也呈显著的正相关（r=0.42,P=0.001）。DS分期与MMP-13基因m RNA表达水平间无明显相关性（r=0.048,P=0.725）。随着对MM患者进行治疗干预，MMP-13基因m RNA表达水平有下降趋势（r=-0.288,P=0.030）。

3、讨论

MM的发生与病毒感染、基因重组、电离辐射、抗原刺激等因素有关[10]。MM多发于老年人，临床表现为骨质破坏、贫血、反复感染、肾功能不全等[11]。高钙血症、骨痛、骨质疏松等骨病是MM重要的特征性病变[12]。且MM具有高度异质性，目前尚无治愈MM的有效疗法，因此，MM患者预后具有明显差异[13-16]。

MMP（基质金属蛋白酶家族）是降解细胞外基质的主要酶类，是一类依赖锌离子和钙离子的内源性蛋白水解酶，它与肿瘤的侵袭、转移及预后密切相关[17]。在正常人体内大多数MMP处于低水平状态，当机体需要时，多种细胞会临时合成或分泌MMP，以酶原形式分泌出的MMP被活化后通过降解和重塑细胞外基质作用，使两者达到动态平衡，以保持细胞外基质的完整性。MMP-13是MMP的重要成员，几乎可降解细胞外基质及基膜的所有成分，其主要作用底物为胶原纤维Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，以及明胶、层粘连蛋白、聚蛋白多糖、纤维连接蛋白等，并且能够激活潜在的基质金属蛋白酶原[18-19]。MMP-13基因位于人染色体11q22，包括10个外显子和9个内含子，长12.5 kb[20]。MMP-13结构区域包括信号肽、前驱肽区、催化区及类血红素结合蛋白区[21]。MMP-13在多种恶性肿瘤组织中均有表达，可能与肿瘤的发生和不良预后有关[22-23]。

本研究采用实时荧光定量PCR法检测MM患者及健康体检者MMP-13基因m RNA表达水平，结果显示，MM患者MMP-13较正常对照组明显升高，与Fu等[24]研究结果相近。提示，MMP-13参与了MM的发生。本研究的MM患者中，有骨病组较无骨病组MMP-13 m RNA明显升高，骨病3-4级组较骨病0-2级组MMP-13 m RNA明显升高，提示MMP-13与骨病严重程度存在相关性，与吴中惠等[25]的研究结果一致。表明MMP-13在MM疾病发生发展、骨质破坏、骨髓瘤细胞增殖、侵犯及转移等方面具有重要作用。研究表明，MMP-13能不可逆地降解Ⅱ型胶原，从而造成关节软骨的破坏[26]。也有研究指出，血清MMP-13在MM及MM骨病患者中的高表达主要与破骨细胞的成熟及活化、促进肿瘤血管的新生，并促进骨髓瘤细胞的生长和远处浸润转移有关[27-28]。

本研究中MM患者MMP-13基因m RNA表达水平ISS分期Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期，Ⅰ期与Ⅲ期差异有显著统计学意义，该结果提示，随着MM患者疾病进展，MMP-13逐步升高，与患者疾病进程同步，MMP-13有望成为监测MM病情的一个新的有效指标。而MM患者MMP-13基因m RNA表达水平DS分期Ⅰ期<Ⅲ期<Ⅱ期，Ⅰ期与Ⅱ期、Ⅲ期表达水平差异均有统计学意义。ISS分期与DS分期的标准不同，ISS分期以β2-微球蛋白和白蛋白的含量为分期依据，DS分期则以血红蛋白、血清钙含量和骨损伤为依据，两种分期的依据不同导致了结果上的差异。治疗后MMP-13 m RNA表达水平低于治疗前，提示MMP-13与治疗效果及预后存在相关性，MMP-13基因m RNA表达水平降低提示治疗方案有效，治疗效果良好。Cocks等[29]的研究表明，外泌体含有多种RNA，是细胞间通信的主要媒介，影响癌症生物学的各个方面，异质性的RNA被外泌体运输转移到靶细胞，从而影响其表型和功能。研究表明，肿瘤外泌体中的m RNA可以传递到受体正常细胞中并产生功能性蛋白质，许多与细胞迁移、血管生成、细胞增殖、免疫反应和组蛋白修饰相关的m RNA转录产物在外泌体中以高水平状态存在[30-31]。MMP-13 m RNA参与骨髓瘤细胞的生长、转移及骨质破坏的分子机制具体与哪种信号通路相关有待于进一步深入研究。

相关性分析显示，MM患者MMP-13与有无骨病、骨病严重程度、ISS分期均呈一定的正相关性，进一步验证了MM患者从无骨病发展到有骨病的同时MMP-13基因m RNA表达水平也随之升高，随着骨病严重程度的增加MMP-13也逐步增高。且对MM患者进行干预治疗后，MMP-13有下降趋势，证实了治疗后MMP-13降低可作为治疗有效的一个判断指标。

综上，MMP-13基因表达水平在MM发生发展及病情判断、预后评估等方面具有一定的指导意义，为进一步研究MMP-13在MM发生发展及预后中的作用机制奠定了前期基础。但本研究样本量有限，在后期研究中应扩大样本量以减少由此造成的误差。

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