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回顾性分析扶正解毒方逆转难治性急性白血病多药耐药的疗效

2020-07-10 181 上传者：管理员

摘要：目的回顾性分析扶正解毒方逆转难治性急性白血病（RAL）多药耐药（MDR）的疗效及对骨髓细胞MDR1 mRNA、P糖蛋白（P-gp）的影响。方法回顾性分析72例接受常规化疗的RAL患者，根据是否使用扶正解毒方治疗分为治疗组（39例，扶正解毒方联合常规化疗）、对照组（33例，单用常规化疗）。统计分析各组治疗前后骨髓缓解率、外周血象和骨髓象、中医证候有效率及不良反应。采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测患者骨髓细胞MDR1 mRNA，流式细胞术检测P-gp表达量。结果治疗后2组患者的外周白细胞计数、原始细胞比例均得到改善，但治疗组具有明显的优势，差异均具有统计学意义（P<0.05）。经过治疗，治疗组（62%）的骨髓缓解率优于对照组（36%），差异有统计学意义（P<0.05）。2组治疗前骨髓细胞多药耐药基因MDR1 mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05）。2组经过治疗，对照组MDR1 mRNA水平较治疗前增高，治疗组MDR1 mRNA水平较治疗前降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。治疗后，治疗组骨髓细胞P-gp表达较治疗前明显降低，且治疗组低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。经过治疗，治疗组（69%）的中医证候有效率优于对照组（42%），差异具有统计学意义（P<0.05）。2组患者治疗中均出现不同程度的全血细胞减少、恶心、呕吐、脱发等，2组患者肝肾功能未见明显异常。结论扶正解毒方联合化疗治疗RAL的临床疗效优于单用常规化疗，且不良反应少，其作用机制可能与降低MDR1编码的P-gp蛋白表达相关。

关键词：
化疗药物
扶正解毒方
抗肿瘤联合化疗方案
白血病
耐药性
血液肿瘤
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难治性急性白血病（refractory acute leukemia,RAL）具有对化疗药物反应差，患者整体复发率高，且极易恶化的特点[1]，这些特点使得在临床治疗困难重重，多年的研究发现，复发、难治的关键在于对常规化疗药物的多药耐药（MDR)[2]。研究证实多药耐药基因（MDR1）在白血病耐药中起着关键的作用，MDR1通用mRNA编码P-糖蛋白（Pgp），而P-gp可以将常规的化疗药物转运至细胞外，进而对化疗产生耐药[3]。因此，阻止化疗药物向细胞外转运或促进化疗药物进入白血病细胞成为逆转白血病多药耐药的关键途径。

中国传统医学认为“久病多虚、久病耗气”，因此患者正气虚弱是RAL多药耐药的关键中医机制。在RAL患者疾病后期，或是进行化疗的中后期均具有正气虚弱的特点，在治疗上应当以扶助正气，祛邪外出为原则。扶正解毒方是我科经过多年的临床实践，以经典方剂为底方总结而来的有效方剂。研究证实，其具有增强患者免疫力，促进肿瘤细胞凋亡及促进骨髓细胞修复等作用，同时可促进白血病干细胞由G0/G1期进入S期、G2/M期从而逆转耐药[4,5]。本研究回顾性分析了应用扶正解毒方联合化疗方案的72例RAL患者病例资料，并对患者骨髓细胞进行了MDR1 mRNA、Pgp检测，报告如下。

1、资料与方法

1.1诊断标准：

急性白血病（AL）的诊断标准参考《血液病诊断及疗效标准》[6]的标准。RAL的诊断尚未有统一的诊断标准，现暂参考2004年第二届全国难治性白血病研讨会“关于RAL的诊断标准建议（草案）”[7]。正虚邪实证参考《中药新药临床研究指导原则》[8]中关于正虚邪实证的标准。

1.2病例选择：

选择2017年6月至2019年6月在山西省中西医结合医院血液科住院治疗的RAL患者72例RAL患者，按治疗方法不同分为治疗组39例，对照组33例，2组基线资料比较，差异无统计学意义。见表1。

表1 72例RAL患者临床情况

纳入标准：(1)符合RAL诊断及中医正虚邪实证辨证标准；(2)采用扶正解毒方联合常规化疗或单独常规化疗方案；(3)具有完整的病例资料和治疗前后保存的骨髓标本；(4)完成1个化疗周期或配合口服扶正解毒方中药已达30 d;(5)患者未用可影响疗效评价的其他治疗药物；(6)年龄18～80岁。

排除标准：(1)伴有不可控制的其他脏器疾病（心脑血管、消化、肾脏、精神等）；(2)依从性差，影响数据收集和疗效评价的患者；(3)对本处方中药过敏者；(4)妊娠、哺乳期妇女；(5)急性早幼粒细胞白血病患者。

1.3治疗方法：

2组患者均给予标准化疗方案和常规对症支持治疗，如碱化、抗感染、保护脏器及输注悬浮红细胞、机器单采血小板等。急性髓系白血病患者常规选用含蒽环类药物方案（如DAC方案，柔红霉素45 mg/m2，第1～3天，阿糖胞苷100 mg/m2，第1～7天，环磷酰胺600 mg/d，第2,4天）；CAG方案（阿糖胞苷150 mg/m2，第1～14天，阿克拉霉素14mg/m2，第1～4天，粒细胞集落刺激因子200μg/m2，第1～14天）；或MAC方案（米托蒽醌12 mg/m2，第1～3天，阿糖胞苷100 mg/m2，第1～7天，环磷酰胺600 mg/d，第2,4天）。急性淋巴细胞白血病给予VDCLP方案（长春新碱2 mg/m2，第1、8、21天；柔红霉素45 mg/m2，第1～3天，第15～17天；环磷酰胺50 mg/m2，第1、15天；天门冬酰胺酶6 000 U/m2，第19～28天；泼尼松60 mg/m2，第1～14天，第15天开始逐渐减量）。治疗组同时给予扶正解毒中药汤剂口服，每日1剂。中药30 d为1个疗程。扶正解毒方法药物组成：人参10 g，黄芪30 g，当归10g，茯苓10 g，白术10 g，女贞子15 g，旱莲草15 g，全蝎6 g，白花蛇舌草30 g，青黛3 g，炙甘草10 g，由山西省中西医结合医院中药制剂药房制备为汤剂。

1.4观察指标及评价方法：

(1)血常规、骨髓象：收集治疗前后患者血常规[WBC、血红蛋白（HGB）、血小板（PLT）]、骨髓细胞形态资料。(2)骨髓缓解率：参照《血液病诊断及疗效标准（2007年版）》统计2组患者完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、无效（NR）及有效率。(3)中医证候有效率：参照《中药新药临床研究指导原则-正虚邪实证》统计患者症候积分，并以尼莫地平法计算积分比，统计临床痊愈率、显效率、有效率、无效率。(4)不良反应：统计2组患者的骨髓抑制、消化道反应、感染、肝肾功能等情况。

1.5反转录聚合酶链反应（RT-PCR)

检测MDR1mRNA，流式细胞术（FCM）检测P-gp(1)试剂及仪器：MDR1引物参照相关文献[9]设计，并由上海生工生物科技公司合成：β肌动蛋白：正向引物：5′-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3′，反向引物：5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATG-GAGGG-3′；MDR1：正向引物：5′-CCCATCATTGCA-ATAGCAGG-3′，反向引物：5′-GTTCAAACTTCTGC-TCCTGA-3′；人淋巴细胞分离液（灏洋，LTS10771);TRIzolTMReagent(Thermo Fisher,15596026);SuperScriptTMDouble-Stranded c DNA Synthesis Kit(Thermo Fisher,11917010);SuperScriptTMⅢOne-Step RT-PCR System with PlatinumTMTaq DNA Polymerase(Thermo Fisher,12574026);Mouse monoclonal(JSB-1)to P Glycoprotein(ABCAM,ab3366）。流式细胞仪（C6,BD）；酶标仪（ELx800,BioTek);RT-PCR仪（CFX96,BioRad）。(2)标本处理：取2 m L患者骨髓血加入离心管中，分别加入2 m L 0.9%氯化钠注射液混匀，再分别加入3 m L人淋巴细胞分离液，混匀后离心（400×g,20 min，室温），用吸管取出白色细胞层，放入2 m L EP管中，然后加入1 m L的磷酸盐缓冲液（PBS），离心（1 000 r/min,5 min，室温），弃上清，备用。(3)RT-PCR检测骨髓细胞MDR1 mRNA：各标本用Trizo法提取RNA后按照说明书逆转录为cDNA。以β-actin基因为对照，进行RE PCR反应。(4)FCM法检测P-gp表达：各标本分别取1×106细胞，加入5μL异硫氰酸荧光素（FITC)P-gp抗体，4℃，避光孵育30 min，加1 mL PBS洗涤（2 000 r/min,5 min），弃上清，保留50μL混匀检测。

1.6统计学方法：

所得数据均采用SPSS 17.0软件进行分析。临床计量数据用表示，组间比较采用t检验或单因素方差检验，计数数据采用χ2检验。实验均重复3次以上。

2、结果

2.1 2组患者外周血象、骨髓原始细胞比较：

见表2。治疗后2组患者的外周白细胞计数、原始细胞比例均得到改善，但治疗组具有明显的优势，差异均具有统计学意义（P<0.05）。

表2 2组治疗前后外周血象骨髓原始细胞比较

2.2 2组临床疗效比较：

见表3。经过治疗，治疗组的骨髓缓解率（62%）优于对照组（36%），差异具有统计学意义（P<0.05）。

表3 2组治疗后缓解率比较

2.3 2组骨髓细胞MDR1 mRNA比较：

2组治疗前骨髓细胞多药耐药基因MDR1 mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05）。2组经过治疗，对照组MDR1 mRNA水平较治疗前增高，治疗组MDR1mRNA水平较治疗前降低，差异均有统计学意义(P<0.05）。

2.4 2组骨髓细胞P-gp表达比较：

见表4。治疗后，治疗组骨髓细胞P-gp表达较治疗前明显降低，且治疗组低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。

表4 2组治疗前后P-gp表达量比较

2.5 2组中医证候有效率比较：

治疗组39例，临床痊愈7例，显效11例，好转9例，无效12例；对照组33例，临床痊愈2例，显效5例，好转7例，无效19例。经过治疗，治疗组的中医证候有效率（69%）优于对照组（42%），差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.6不良反应：

2组患者治疗中均出现不同程度的全血细胞减少、恶心、呕吐、脱发等，2组患者肝肾功能未见明显异常。不良反应给予对症处理后好转。

3、讨论

白血病MDR是指白血病细胞对一种药物具有抗药性的同时，又会对其他结构或作用机制不同的药物产生抗药性[10]。最新的研究发现，白血病细胞耐药的发生与细胞膜转运蛋白相关ABC，这些膜转运蛋白的过度表达使进入细胞的药物外排出细胞膜，从而规避化疗药物的损伤[11]。其中P-gp是目前研究最热的膜蛋白之一，该蛋白是由MDR基因MDR1编码的一种跨膜糖蛋白[12]，研究发现，P-gp与化疗药物结合后通过自身的三磷酸腺苷（ATP）酶，将化疗药物外排，从而导致细胞内药物浓度降低进而发生耐药[13]。因此，能够降低或是抑制P-gp蛋白的表达都将改善白血病MDR的发生。

中医认为，急性白血病乃是正气虚损，邪气内侵所致的病症，在疾病的中晚期，特别是微小残留病期，邪毒蛰伏髓源，正虚难以祛邪，所以总的辨证为正虚邪实证，在治疗上以扶正解毒为主。扶正解毒方可以提高患者的免疫能力，促进白血病化疗后的骨髓伤，减少白血病耐药的发生。焦宁等[14]研究发现扶正解毒方可通过降低c-myc、存活蛋白（survivin）的表达来干预白血病细胞的周期变化，进而逆转白血病细胞的耐药。闫理想等[15]研究亦发现，扶正方可降低白血病患者的P-gp表达，联合化疗可增加RAL患者的临床有效率。

本研究发现，扶正解毒方联合化疗具有增效的作用，提示扶正解毒方联合化疗具有提高RAL对常规化疗药物敏感性的作用，从而逆转RAL的MDR。治疗组在中医症状改善及不良反应方面具有明显的优势，提示扶正解毒方联合化疗可提高RAL患者的生存状态和生活质量，减少化疗不良反应；治疗组骨髓细胞MDR1 mRNA表达量明显下降，同时MDR1 mRNA编码的膜蛋白P-gp表达比例亦明显降低，提示扶正解毒方联合化疗可降低多药耐药基因MDR1 mRNA及其编码的P-gp蛋白表达。以上研究说明扶正解毒方联合化疗可提高RAL患者的临床疗效，对RAL患者的耐药具有逆转作用，其作用机制可能与降低MDR1编码的P-gp蛋白表达相关。

参考文献：

[4]徐瑞荣,刘奎,王晓玲,等.益气养阴方及其拆方影响急性髓细胞白血病细胞Flt3和N-ras表达研究[J].中国中西医结合杂志,2010,30(6):575-578.

[5]吴国琳,普兴宏,李天一,等.养阴益气活血方对干燥综合征NOD小鼠血清及颌下腺Th1/Th2免疫平衡的影响[J].中国中西医结合杂志,2013,33(12):1653-1657.

[6]张之南.血液病诊断及疗效标准[M].3版.北京:北京科学出版社,2007:19-21.

[7]第四届全国难治性白血病研讨会.关于难治性急性白血病诊断标准的商讨纪要[J].白血病·淋巴瘤,2004,13(2):70.

[8]郑筱萸.中药新药临床研究指导原则[M].北京:中国医药科技出版社,2002:174.

[14]焦宁,陈冲,徐瑞荣.益气养阴方及其拆方对急性髓细胞白血病细胞细胞周期及相关蛋白的调控研究[J].中华中医药学刊,2014,32(4):730-732,962-963.

[15]闫理想,史哲新,姜静,等.益气养阴方逆转难治性急性白血病多药耐药临床观察[J].北京中医药大学学报,2015,38(1):68-72.

冯全管,杨承玉,胡慧平.扶正解毒方逆转难治性急性白血病多药耐药回顾性分析[J].山西医药杂志,2020,49(11):1340-1343.