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急性髓系白血病中OTUB1基因的表达及其对细胞生长的影响

2020-07-10 505 上传者：管理员

摘要：目的:探讨去泛素化酶OTUB1在急性髓系白血病(AML)中的表达及对白血病细胞增殖、凋亡的影响。方法:通过生物信息学分析探讨OTUB1在急性髓系白血病患者中的表达及与预后的关系。使用CCK-8法检测OTUB1对白血病细胞增殖的影响,流式细胞术检测对细胞周期和凋亡的影响,分光光度法检测对Caspase-3活性的影响。结果:GEPIA数据库分析显示OTUB1基因在AML患者中的表达显著升高(P<0.05),并且OTUB1高表达的AML患者总生存率明显降低[LogrankP=0.023,HR(high)=1.9,P(HR)=0.026]。白血病HL-60细胞中使用siRNA干扰OTUB1表达后,细胞的增殖活力明显下降(P<0.05),处于G0/G1期的细胞明显增多(P<0.05),S期和G2/M期的细胞明显减少(P<0.05)。下调OTUB1表达后HL-60细胞的凋亡率较对照组明显增加(P<0.05),细胞中Caspase-3的活性较对照细胞明显增强(P<0.05)。结论:OTUB1在急性髓系白血病患者中高表达并且与预后负相关,其能促进白血病细胞的增殖,抑制其凋亡。

关键词：
OTUB1
凋亡
增殖
白血病
血液肿瘤
预后
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急性髓系白血病(AML)是血液系统常见恶性肿瘤,但是仍然缺乏有效的治疗靶标和预后评判指标[1]。泛素化是蛋白质重要的翻译后修饰形式,对于蛋白质的稳定性、活性等生理功能至关重要[2]。OTUB1是近年来发现的去泛素化酶家族成员,研究表明其对一些实体肿瘤细胞的增殖、凋亡、耐药性具有重要的调控作用[3],但OTUB1基因在急性髓系白血病中的作用尚不明确。本研究旨在探讨OTUB1基因在AML患者中的表达及对AML细胞生长的影响。

1、材料与方法

1.1材料

人髓系白血病细胞HL-60购于中国科学院细胞库。RPMI1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司。细胞转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。CCK-8增殖活性检测试剂盒购自日本同仁化学研究所。膜联蛋白V-碘化丙啶(AnnexinV-FITC/PI)细胞凋亡试剂盒及细胞周期试剂盒购自美国BD公司。凋亡活性检测试剂盒、caspase-3活性检测试剂盒购自美国Promega公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养

使用含10%灭活胎牛血清的RPMI1640培养基,于37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养HL-60细胞。常规传代、换液,取对数生长期的细胞进行后续实验。

1.2.2细胞转染

使用Lipofectamine2000将OTUB1siRNA(si-OTUB1组)和Controlsi RNA(si-NC组)转染至细胞,参照转染试剂盒说明进行操作。

1.2.3细胞活力检测

取对数期生长的HL-60细胞重悬成细胞悬液,接种至96孔板,转染siRNA后继续培养72h。培养终止2h前加入CCK-8试剂,孵育4h后使用酶标仪检测吸光度。

1.2.4细胞周期检测

取对数期生长的HL-60细胞接种至6孔板,转染siRNA后继续培养72h。参照细胞周期检测试剂盒说明书对细胞进行染色,流式细胞术分析处于G0/G1、S或G2/M期细胞与总细胞的比例。

1.2.5细胞凋亡检测

将对数期生长的细胞重悬后接种于6孔板中,转染siRNA后继续培养72h。使用AnnexinV-FITC和PI标记细胞,流式细胞仪检测各组细胞凋亡的情况。

1.2.6Caspase-3活性检测

将对数期生长的细胞接种至96孔板,转染siRNA后继续培养72h。按照试剂盒说明书检测Caspase-3酶活性,计算样品中所含的酶活力单位[4]。

1.3临床相关性分析

GEPIA是北京大学研制开发的基于TCGA和GTEx数据库在线应用数据库。该数据库汇总了9736个肿瘤组织样本和8587个正常组织样本,不仅可以用来分析特定基因在肿瘤组织和正常组织中RNA水平的表达差异,还可以分析基因表达水平与患者预后的相关性。本研究中我们使用GEPIA数据库比较了OTUB1在AML细胞和正常细胞中的表达情况,并分析了OTUB1的表达高低与AML患者预后的关系。

1.4统计学分析

采用SPSS22.0版软件进行处理。所有数据以均数±标准差(x¯±s)表示,使用t检验进行两组间比较。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1OTUB1在AML细胞和正常细胞中的表达

使用GEPIA数据库分析OTUB1mRNA在AML患者细胞(n=173)和正常对照细胞(n=70)中的表达水平,结果显示与正常细胞相比,OTUB1在AML中的表达显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)(图1)。

图1OTUB1mRNA在AML患者和正常对照中的表达

2.2OTUB1的表达与患者生存率的关系

使用GEPIA数据库分析OTUB1mRNA水平与AML患者预后的相关性,结果显示OTUB1mRNA的表达水平对AML患者的总生存率有显著影响。与OTUB1低表达组(n=53)相比,OTUB1高表达(n=53)的AML患者总生存率明显降低[LogrankP=0.023,HR(high)=1.9,P(HR)=0.026](图2)。

图2AML患者中OTUB1表达的总体生存曲线

2.3干扰OTUB1的表达对白血病HL-60细胞增殖的影响

使用针对OTUB1的siRNA(si-OTUB1)转染HL-60细胞,发现OTUB1mRNA的表达水平明显降低(t=16.546,P<0.001)。与对照组细胞相比,干扰OTUB1表达后HL-60细胞的增殖活力在24h、48h、72h均明显下降(t=4.743,P<0.01;t=6.522,P<0.001;t=12.056,P<0.001)(图3)。

2.4干扰OTUB1的表达对白血病HL-60细胞周期的影响

使用si-OTUB1转染HL-60细胞,发现下调OTUB1表达后处于G0/G1期的细胞明显增多(t=5.912,P<0.05),S期和G2/M期的细胞明显减少(t=5.836,P<0.05;t=5.565,P<0.05)(图4)。

2.5干扰OTUB1的表达对白血病HL-60细胞凋亡和Caspase-3活性的影响

使用si-OTUB1转染HL-60细胞,发现下调OTUB1表达后HL-60细胞的凋亡率[(12.13±1.67)%]较对照组[(4.3±0.65)%]明显增加(t=7.568,P<0.01)。与对照组细胞相比,干扰OTUB1后HL-60细胞中Caspase-3的相对活性较对照组细胞明显增强(t=8.075,P<0.05)(图5)。

3、讨论

虽然随着新的化疗药物的出现和造血干细胞移植的开展,AML病人的无病生存期有很大改善,但是疾病的复发仍是临床上亟待解决的问题[5]。如何发现新的预后评估指标,对病人进行精准分层和治疗,对于提高AML病人疗效和预后十分重要。

图3干扰OTUB1对HL-60细胞增殖的影响

图4干扰OTUB1对HL-60细胞周期的影响

图5干扰OTUB1对HL-60细胞Caspase-3活性的影响

蛋白的泛素化修饰在泛素连接酶和去泛素化酶的调控下处于动态平衡,参与众多病理生理过程,在肿瘤发生发展中扮演着重要角色[6,7]。OTUB1是去泛素化酶家族中的一员,可以参与调控转化生长因子(TGF-β)、抑癌基因p53、细胞凋亡抑制蛋白(c-IAP)等多条肿瘤相关的信号通路,进而影响肿瘤细胞的增殖、侵袭和耐药性[8]。新近的研究还发现OTUB1能去除Akt的泛素化修饰,阻止IL-15介导的Akt的活化,从而抑制CD8+T细胞和NK细胞功能的发挥,维持免疫稳态平衡。敲除OTUB1使得小鼠体内CD8+T细胞和NK细胞活性增加,抗肿瘤免疫显著增强,肿瘤负荷明显减少[9]。此外,临床分析还显示,OTUB1在肺癌[10]、乳腺癌[11]、前列腺癌[12]、胶质瘤[13]、结肠癌[14]等肿瘤中存在高表达,并且与肿瘤的侵袭、转移密切相关。例如,RAS基因在肺癌发生发展中扮演重要角色,Baietti等[10]发现OTUB1能通过抑制RAS蛋白的泛素化,增强RAS基因的致癌性。OTUB1的表达在野生型KRAS肺腺癌病人中明显升高,能促进ERK的磷酸化及肿瘤细胞的增殖,并且与病人的不良预后相关。Snail蛋白通过影响上皮-间质转化在肿瘤进展和转移中发挥重要作用,Zhou等[15]发现OTUB1能够通过抑制Snail蛋白的泛素化降解,促进食管癌的转移。临床分析也显示食管鳞癌中OTUB1的表达明显升高,提示病人预后不良。但是关于OTUB1在血液系统肿瘤中的作用,尤其是在AML中的作用,目前尚不明确。

通过对数据库进行生物信息学分析,我们发现OTUB1在AML患者中的表达显著升高。生存分析表明OTUB1表达水平与AML患者预后具有显著相关性,OTUB1高表达的AML患者总生存率明显降低,从而提示OTUB1可能参与AML的疾病发展。我们在HL-60细胞中干扰OTUB1的表达,发现细胞的增殖活力下降,细胞周期阻滞,表明下调OTUB1能抑制AML细胞的生长。我们还发现干扰OTUB1的表达后,AML细胞的凋亡明显增加,Caspase-3的活性明显升高,提示OTUB1能够抑制Caspase-3的活性,进而减少AML细胞凋亡,加速疾病进展,但是OTUB1促进AML细胞生长的机制还值得进一步深入探讨。目前已经研发出一些去泛素酶的小分子抑制剂,体外实验显示其对某些肿瘤细胞具有显著杀伤作用[16],针对OTUB1抑制剂的研发将有助于实现AML的靶向治疗。

综上所述,本研究表明OTUB1在AML患者中高表达,并且与病人预后相关,其可能通过抑制Caspase-3活性促进AML进展。OTUB1有望成为AML预后评估和治疗干预新的靶点。

参考文献：

[3]段菲,张金玉,乔树,等.OTUB1在肿瘤中的研究进展[J].癌症进展,2017,15(12):1392-1395,1448.

[4]张鹏,丁蓉芳,欧阳玲,等.科罗索酸对白血病K562细胞增殖和凋亡的影响[J].现代肿瘤医学,2019,27(18):3172-3175.

[7]张敬洋,陈晓煜,胡涛,等.去泛素化酶在肿瘤发生中的作用[J].癌变·畸变·突变,2015,27(06):484-486.

[16]范广晗,朱虹,方倚正,等.去泛素化酶在肿瘤中的作用及其抑制剂相关研究进展[J].药学学报,2018,53(02):169-176.

欧阳玲,张鹏,李勇华,蒋祖军.OTUB1基因在急性髓系白血病中的表达及对细胞生长的影响[J].现代肿瘤医学,2020,28(15):2556-2559.

基金:国家自然科学基金(编号:81600182);广东省自然科学基金(编号:2019A1515010978);广州市科技计划项目(编号:201804010284)