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探讨miR-224对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞的潜在机制

2020-10-17 242 上传者：管理员

摘要：目的:探讨miR-224对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞增殖和侵袭影响的潜在机制。方法:收集2011年6月至2017年12月在昆明医科大学第一附属医院血液科确诊的76例DLBCL初诊患者血液标本(DLBCL组)、41例健康体检者血液标本(正常对照组)，以及人淋巴内皮细胞HLEC和DLBCL细胞系HBL1、OCI-LY10、OCI-LY8、OCI-LY19。使用RT-qPCR法检测miR-224和PIK3CDmRNA的表达水平。CCK-8法和克隆形成实验检测HBL1细胞增殖能力，Transwell实验检测HBL1细胞侵袭能力。双荧光素酶报告基因验证miR-224与PIK3CD的靶向关系。Westernblot检测PIK3CD蛋白的表达水平。结果:miR-224在DLBCL患者血液中表达显著低于正常对照组(P<0.01);过表达miR-224,HBL1细胞增殖和侵袭能力均显著降低(P<0.01)。PIK3CD是miR-224的靶基因，敲减PIK3CD能显著抑制HBL1细胞的增殖和侵袭能力(P<0.01)。结论:miR-224在DLBCL进展中起着关键的作用，miR-224靶向抑制PIK3CD可降低DLBCL细胞系HBL1细胞的增殖和侵袭能力。

关键词：
miR-224
PIK3CD
侵袭
弥漫大B细胞淋巴瘤
细胞增殖
血液肿瘤
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弥漫大B细胞淋巴瘤是一种侵袭性非霍奇金淋巴瘤，每年确诊病例约占淋巴瘤总病例的30%-40%[1]。由于DLBCL早期诊断困难且其侵袭性高[2,3]，导致DLBCL患者预后较差。因此，了解DLBCL细胞增殖与侵袭的机制，有望为DLBCL早期诊断和治疗提供新的分子靶点。

MicroRNA(miRNA)是一类天然存在的非编码短RNA，通过与mRNA的3'UTR中互补靶序列结合发挥其负调控作用[4]。研究表明，miRNA的异常表达影响DLBCL细胞增殖与侵袭，具有作为DLBCL诊断和患者预后标志物的潜力[5]。Pedersen等[6]研究发现，高表达的miR-155靶向SHIP1促进DLBCL发展进程。Farina等[7]研究发现，miR-26a通过调控P35表达，从而抑制DLBCL细胞增殖，同时抑制小鼠体内DLBCL肿瘤生长。Fan等[8]研究发现，miR-10a通过靶向BCL6抑制DLBCL细胞增殖，并诱导细胞凋亡。有研究表明，miR-224在DLBCL组织中低表达[9]。Goto等[10]研究表明，miR-224靶向TPD52抑制膀胱癌细胞迁移和侵袭。然而，miR-224在DLBCL中的作用尚不明确，本研究旨在探讨miR-224对DLBCL细胞生物学功能的影响及其可能的分子机制，为寻找DLBCL治疗靶点提供新思路。

1、材料和方法

1.入组病例

2011年6月至2017年12月在昆明医科大学第一附属医院血液科确诊的DLBCL初诊患者76例(DL-BCL组)、于本院进行健康体检并证实无任何肿瘤相关疾病的健康体检者41例(正常对照组)。采集DLBDL患者及对照者的血液并立即置于-80℃冷冻保存备用。病例入组标准:(1)根据2008年WHO公布的DLBCL诊断标准确诊的患者;(2)于本院进行淋巴结切除，病理类型证实为CD20阳性的DLBCL患者;(3)能够并愿意遵照研究方案操作。排除标准:(1)具有影响试验结果解释的其他恶性肿瘤史的患者;(2)合并有其他免疫系统疾病的患者;(3)患者不同意样本的采集。血液标本采集前均告知患者并签署知情同意书，研究方案得到医院伦理委员会批准。

2.试剂与仪器

人淋巴内皮细胞HLEC购自武汉原生原代生物医药科技有限公司，DLBCL细胞系HBL1、OCI-LY10、OCI-LY8和OCI-LY19均购自上海雅吉生物科技有限公司。RPMI1640培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司。LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司。miR-224mimic、miR-224inhibitor及其阴性对照(NC)均购自上海吉玛制药技术有限公司。全蛋白提取试剂盒、细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒、SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒均购自美国Bio-Rad公司。TRIzol试剂盒购自上海纪宁生物有限公司。SYBRGreen荧光定量PCR试剂盒和逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司。CCK-8试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司。Transwell小室购自美国Millipore公司。双荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司。CO2培养箱购自德国Heraeus公司;倒置显微镜购自日本Olympus公司;紫外分光光度计购自美国GEAmersham公司;RealtimeRT-PCR仪、半干转膜仪及凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad公司。

3.细胞培养与转染

HLEC、HBL1、OCI-LY10、OCI-LY8和OCI-LY19细胞置于含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，加入100U/ml青霉素和100U/ml链霉素，于37℃、5%CO2培养箱中常规培养。当细胞融合度达80%时，使用LipofectamineTM2000转染试剂盒分别将miR-224mimic、miR-224inhibitor或si-PIK3CD及相应阴性对照(NC)转染至HBL1细胞，将细胞置于37℃、5%CO2培养箱内培养48h，筛选出稳定转染的细胞株，实验重复3次。转染分组如下:NC组(阴性对照组)、miR-mim组(miR-224mimic转染组)、Ctrl组(空白对照组)、si-PIK3CD组(si-PIK3CD转染组)、si-PIK3CD+miR-inh组(si-PIK3CD和miR-224inhibitor共转染组)。

miR-224和PIK3CD表达水平的RT-qPCR检测

收集DLBCL患者及正常对照组血液样本及上述各组细胞，使用TRIzol试剂盒分别提取血液及各组细胞总RNA，测定其浓度与纯度。使用逆转录试剂盒将RNA逆转录得到cDNA,SYBRGreen荧光定量PCR试剂盒测定目标mRNA表达水平，选择U6和GAPDH作为内参(引物序列见表1,F:正向引物，R:反向引物)，以2-△△Ct计算相对表达量，实验重复3次。

PIK3CD表达水平的Westernblot检测

使用RAPI裂解液提取细胞总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜，室温封闭2h。加入一抗(PIK3CDanti-body,1∶1000;GAPDHanti-body,1∶1000)，于4℃孵育过夜，充分洗涤后加入羊兔IgG二抗(1∶2000)，室温孵育2h。洗膜，ECL显色、拍照，ImageJ软件分析灰度值，计算蛋白相对表达量。实验重复3次。

CCK-8法检测细胞增殖活力

收集上述各转染组细胞接种于96孔板(1×104/ml),37℃、5%CO2恒温培养，每孔设置3个复孔。培养24、48、72和96h，于每个时间点前4h加入CCK-8试剂，避光孵育4h，酶标仪于450nm波长处测定OD值。实验重复3次。

克隆形成实验检测HBL1细胞增殖能力

胰蛋白酶消化各转染组细胞并接种于6孔板(500个/孔)，于37℃、5%CO2培养箱中培养14d，移除培养液，使用PBS洗涤2次，甲醇固定15min,1%结晶紫染色，显微镜下计数(>50个细胞记为1个克隆)，实验重复3次。

Transwell实验检测HBL1细胞侵袭能力

各转染组细胞制备胞悬液后，取50μl接种于Transwell小室，37℃培养24h。取出小室，甲醇固定后用0.5%结晶紫染色，显微镜下观察，计数穿膜细胞数。实验重复3次。

双荧光素酶报告基因实验验证miR-224与PIK3CD的靶向关系

构建PIK3CD-WT和PIK3CD-MUT荧光素酶报告质粒，分别共转染阴性对照/miR-224mimic,48h后收集细胞，PBS洗净后加入PLB裂解液，取上清液10μl于96孔板，采用双荧光素酶报告基因系统检测双荧光素酶活性。实验重复3次。

4.统计学分析

使用SPSS20.0软件进行统计分析，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，事后检验采用LSD-t方法，GraphpadPrism6软件绘制实验数据相关图片。P<0.05、P<0.01示差异有显著和非常显著统计学意义。

2、结果

miR-224在DLBCL患者中的表达

RT-qPCR检测结果显示，miR-224在DLBCL患者血液中表达显著低于正常对照组(t=3.38,P<0.01)(图1A)。同时，RT-qPCR结果还显示，miR-224在DLBCL细胞系(HBL1、OCI-LY10、OCI-LY8、OCI-LY19)中表达显著低于人淋巴内皮细胞(HLEC)(F=79.53,P<0.01)，且miR-224在HBL1细胞系中表达均显著低于OCI-LY8和OCI-LY19细胞系(LSD-t=6.45、8.66,P<0.01)。上述结果表明，miR-224在DLBCL患者血液和细胞中低表达。

过表达miR-224对HBL1细胞增殖和侵袭的影响RT-qPCR检测结果显示，相比于NC组，转染miR-224mimics显著上调miR-224表达水平(t=6.52,P<0.01)(图2A)。CCK-8和克隆形成实验结果显示，相比于NC组，过表达miR-224显著降低HBL1细胞的增殖活力(t24h=4.06,P<0.05;t48h=8.63,t72h=7.42,t96h=6.99，均P<0.01;t=5.73,P<0.01)(图2B、2C)。Transwell实验结果表明，相比于NC组，过表达miR-224能使HBL1细胞侵袭能力显著下调(t=6.76,P<0.01)(图2D)。综上所述，过表达miR-224显著抑制HBL1细胞增殖和侵袭能力。

PIK3CD与miR-224的靶向关系

生物信息学数据库PITA预测结果显示，PIK3CD是miR-224的候选靶基因(图3A)。双荧光素酶报告基因结果显示，相比于NC组，过表达miR-224能使PIK3CD-WT荧光活性下调，PIK3CD-MUT荧光活性与NC组无显著差异(t=6.50,P<0.01)(图3B)。Westernblot检测结果显示，相比于NC组，过表达miR-224显著下调PIK3CD表达水平(t=9.82,P<0.01)(图3C)。RT-qPCR检测结果显示，PIK3CD在DLBCL患者血液中表达显著高于正常对照组(t=7.43,P<0.01)(图3D)。上述结果表明，PIK3CD是miR-224的靶基因，且在DLBCL患者血清中高表达。

miR-224靶向PIK3CD对HBL1细胞增殖和侵袭的调控作用

Westernblot检测结果显示，相比于空白对照组(Ctrl组)，敲低PIK3CD显著下调PIK3CD表达水平(F=108.61,P<0.01;LSD-t=12.56,P<0.01);同时敲低PIK3CD和miR-224,PIK3CD表达水平与空白对照组相比无显著差异(P>0.05)(图4A)。CCK-8和集落形成实验结果显示，相比于空白对照组，敲低PIK3CD能明显抑制HBL1细胞增殖活力(F24h=17.66,F48h=56.22,F72h=41.29,F96h=48.99，均P<0.01;LSD-t24h=6.40,LSD-t48h=9.35,LSD-t72h=6.97,LSD-t96h=11.70，均P<0.01;F=32.44,P<0.01;LSD-t=7.14,P<0.01);同时敲低PIK3CD和miR-224,HBL1细胞增殖情况与空白对照组相比均无显著差异(P>0.05)(图4B、C)。Transwell实验结果表明，相比于空白对照组，敲低PIK3CD显著下调HBL1细胞侵袭能力(F=49.41,P<0.01;LSD-t=8.21,P<0.01);同时敲低PIK3CD和miR-224能使HBL1细胞侵袭能力恢复(均P>0.05)(图4D)。上述结果表明，miR-224靶向PIK3CD能抑制HBL1细胞增殖和侵袭。

3、讨论

DLBCL是成人中最常见的恶性淋巴瘤[11]，患者生存率极低[12]。DLBCL细胞的增殖和侵袭与肿瘤的生长和转移密切相关[13]，然而，关于DLBCL细胞增殖和侵袭机制的研究较少。miRNA是一类非编码小RNA，在多种癌症细胞增殖和侵袭过程中发挥重要作用，其中，miR-224被报道在多种癌症细胞中均异常表达[14]。研究表明，高表达的miR-224可促进结直肠癌细胞增殖和侵袭[15,16,17]。Li等[18]研究发现，miR-224靶向HOXD10促进非小细胞肺癌细胞侵袭与转移。He等[19]研究表明，miR-224靶向RASSF8促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。Huang等[20]研究发现，miR-224靶向RASSF8，促进宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭。本研究结果表明，miR-224在DLBCL组织及细胞系中低表达，过表达miR-224抑制HBL1细胞增殖和侵袭。

PIK3CD是PI3K-AKT信号通路的重要组成部分，在细胞增殖、迁移及癌症发生中发挥着重要作用[21]。Chen等[22]研究发现，PIK3CD通过激活AKT/GSK-3β/β-catenin信号轴，促进结直肠癌细胞增殖和侵袭。Cui等[23]研究结果表明，PIK3CD通过上调c-myc和p-AKT水平、下调p21和p27水平，促进DLBCL细胞增殖并抑制凋亡。Dong等[24]研究报道，PIK3CD与CD9表达呈负相关，且PIK3CD和CD9均可作为滤泡淋巴瘤患者的预后标志物。Cui等[25]研究发现，miR-125b靶向PIK3CD可抑制肿瘤生长并促进宫颈癌细胞凋亡。本研究结果显示，PIK3CD是miR-224的靶基因，PIK3CD在DLBCL组织中高表达，敲减PIK3CD显著抑制HBL1细胞增殖和侵袭。

综上所述,miR-224靶向PIK3CD,抑制HBL1细胞增殖和侵袭｡miR-224为DLBCL新的诊断生物标志物和治疗分子靶点的开发提供了新思路｡

谢瑜,谭琳,李云涛,曾云.miR-224靶向PIK3CD影响DLBCL细胞增殖和侵袭的机制研究[J].中国实验血液学杂志,2020,28(05):1578-1584.

基金:昆医联合专项(2017FE468(-031)).