多发性骨髓瘤是一种起源于B淋巴细胞异常增生，以血液和尿液中产生异常增多的单克隆免疫球蛋白为特征的恶性肿瘤[1]。该病多发于中老年人。随着蛋白酶体抑制剂和免疫调节剂等新的靶向药物应用于临床治疗，MM患者的预后情况得到一定程度的改善，但MM仍是一种不可治愈的恶性血液病，面临着耐药等多种问题。

MTH1是一种主要存在于脱氧核糖核苷酸三磷酸池中的一种焦磷酸酶，它能够水解8-oxo-dGTP以及2-OH-dATP生成相应的磷酸酯[2]。过量的8-oxodGTP及2-OH-dATP参与到DNA复制中将会导致DNA损伤及细胞衰老[3]。活性氧在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。持续氧化应激也是恶性肿瘤的特征之一[4,5]。有研究发现，MTH1能保护乳腺癌、肾癌、结肠癌、非小细胞癌、黑色素瘤以及骨肉瘤等肿瘤细胞不受高水平ROS导致的损伤[6,7,8,9,10,11,12]。MTH1在正常细胞中非必需[11]，但在肿瘤细胞中必不可少，故MTH1这一靶点成为最近肿瘤研究的热点，MTH1抑制剂也成为靶向治疗肿瘤的新方向。也有研究分析了MTH1与MM的关系，阐述了MTH1过表达与晚期疾病相关，在新诊断的MM中，过表达可能与硼替佐米疗效差相关[2]。因此，有必要对MTH1与MM的关系进行深入研究。

1、材料和方法

1.试剂与仪器

TH588和TH5427均购自美国MedChemExpress(MCE)公司，分装于-80℃，短时间内置于-20℃保存。CD138分选磁珠购自德国MiltenyiBiotech公司，淋巴细胞分离液(人)购自天津市灏洋生物，TR-IzolReagen购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒和Q-PCRmix购自北京全式金生物，荧光素酶底物购自美国Promega公司，RPMI1640细胞培养基和磷酸盐缓冲液)购自美国Gibco公司，胎牛血清为美国HyClone公司生产，ANNEXINVAPC凋亡检测试剂盒购自美国eBioscience公司，ABI7500FASTQPCR仪购自美国ABI公司，高速低温离心机购自美国Thermo公司。

2.细胞系及其培养

本实验室构建的luciferase稳定表达的MMU266细胞系，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，2-3d换液1次，取对数生长期的细胞进行实验。

MM患者标本CD138+细胞分选以及RNA的提取5例标本均来自青岛大学附属医院血液科MM患者的诊断穿刺骨髓，肝素抗凝。取回的标本与淋巴细胞分离液按1∶1比例置于50ml离心管中，800×g离心，收集骨髓单个核细胞，用CD138标记磁珠进行CD138细胞分选，分选出CD138-及CD138+细胞，用流式细胞仪进行分选效率验证，将得到的CD138-及CD138+细胞应用TRIzol分别进行RNA提取，用分光光度计检测所得到的RNA浓度及纯度，获得合格的样本。

MTH1及NUDIX其他成员在MMCD138+细胞中的表达检测

将检测合格的RNA样本按照反转录试剂盒操作说明书进行反转录，之后进行Q-PCR，以β-actin为内参，内参引物正向序列为5'-CCTGGCACCCAGCA-CAAT-3'，内参引物反向序列为5'-GGGCCG-GACTCGTCATAC-3';MTH1正向引物序列为5'-GCTCATGGACGTGCATGTCTT-3',MTH1反向引物序列为5'-GTGGAAACCAGTAGCTGTCGT-3'[2]。以2-ΔCT值表示MTH1的相对表达量。

白细胞介素6(IL-6)对MM细胞系MTH1表达水平影响的检测

取对数生长期U266细胞5×105/ml的终浓度接种于12孔培养板，每孔培养体系为总体积1ml的无血清培养基。分别加入终浓度为25ng/ml和100ng/ml的IL-6，并设立对照组，24h后收集细胞，提取RNA，反转录进行Q-PCR检测MTH1表达水平的变化。

细胞增殖的检测以及TH588对MTH1表达水平的影响

取对数生长期U266细胞，以1×104/孔接种于96孔培养板，每孔100μl体系。分别加入终浓度为1、2.5、5、10μmol/L的TH588，并设立对照组，每组设4个复孔，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中孵育，实验结束前每孔避光加入50μl的荧光素底物luciferin，每孔吸取带底物的悬液100μl于不透光96孔板中，置酶标仪上检测TH588处理后0、48、72h荧光强度。取对数生长期U266细胞2×105/ml的终浓度接种于12孔培养板，每孔总体积1ml。分别加入终浓度为1、2.5、5、10μmol/L的TH588，并设立对照组。48h后收集细胞，提取RNA进行反转录后，Q-PCR检测MTH1表达的变化。

3.细胞形态观察及DAPI染色检测

取对数生长期U266细胞5×105/ml的终浓度接种于12孔培养板，每孔总体积1ml。分别加入终浓度为1、2.5、5、10μmol/L的TH588，并设立对照组。48h后收集细胞，PBS洗涤2次。以1mlPBS重悬细胞，于显微镜下观察细胞形态，用终浓度为100ng/ml的DAPI染色3-5min，在激发波长为461nm的荧光显微镜下观察U266细胞的凋亡形态。

4.细胞凋亡的检测

取对数生长期U266细胞2×105/ml的终浓度接种于12孔培养板，每孔总体积1ml。分别加入终浓度为1、2.5、5、10μmol/L的TH588，并设立对照组。48h后收集细胞，300×g离心5min,PBS洗涤2次，使用eBioscienceAnnexinVAPC凋亡试剂盒，1×bindingbuffer洗涤1次，使用100μlbindingbuffer重悬，标记AnnexinVAPC，室温避光孵育10min,1×bindingbuffer洗涤1次，500μl重悬，加5μlPI,10min后流式细胞仪检测。使用Flowjo分析存活细胞，即AnnexinVAPC与PI双阴性细胞的比例。

5.统计学分析

全部数据采用SPSS21.0软件进行分析，结果以表示，组间数据通过独立样本t检验进行比较。实验重复3次，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

MTH1及NUDIX其他成员在MMCD138-及CD138+细胞中的表达

经过磁珠分选，得到了MM患者CD138+细胞，并用流式细胞仪进行阳性率检测，如图1A所示，从左到右依次为分离出的单个核细胞、CD138-及CD138+中CD138+的比例，分别为13.7%、0.125%和86.5%。计算出MM标本相关基因在CD138-和CD138+相对应的2-ΔCT值，用PRISM软件作图直观比较其差异，可以看出MTH1、NUDT2、NUDT5和NUDT21在MM患者CD138+细胞中均高表达，与CD138-比较差异均有统计学意义(P<0.05)(图1B)。对于IL-6能否调控MTH1的表达，根据Q-PCR的结果分析，未应用IL-6的MM细胞系U266的MTH1表达2-ΔCT值为0.01775±0.0008，当IL-6浓度为25ng/ml时，其值为0.04370±0.0016，当IL-6浓度为100ng/ml时，其值为0.02596±0.0008。与对照组相比，应用IL-6的细胞MTH1表达水平均有不同程度提高，差异有统计学意义(P<0.01)(图1C)。

TH588通过抑制MTH1表达抑制MM细胞增殖作用

根据图1结果显示，MTH1、NUDT2、NUDT5和NUDT21在MM患者CD138+细胞中的表达要高于CD138-细胞，但NUDT2和NUDT21目前尚无可应用的抑制剂，故选取MTH1抑制剂TH588及NUDT5抑制剂TH5427作用于U266细胞。Q-PCR结果显示，TH588作用于U266细胞系48h后，与对照组相比，实验组的MTH1表达水平降低(图2)。对照组2-ΔCT值为0.007±0.0003,1μmol/L组2-ΔCT值为0.003±0.0002,5μmol/L组2-ΔCT值为0.004±0.0004,10μmol/L组2-ΔCT值为0.003±0.0004(P<0.05)。实验组的荧光强度与对照组比较，差异有统计学意义(表1)。应用48h后，1μmol/L的药物浓度没有起到明显抑制细胞增殖的作用;当药物浓度达到2.5μmol/L，抑制增殖作用明显(P<0.05)。应用72h后，与对照组相比，1μmol/L的药物浓度即有抑制细胞增殖的作用(P<0.05);随着药物浓度进一步升高，抑制作用愈明显(r=-0.91)。同样，将NUDT5抑制剂TH5427应用于U266，发现其不能对U266细胞起到抑制增殖的作用(表2)，因此后续研究主要围绕TH588及MTH1进行。

TH588应用后U266细胞形态变化以及DAPI染色后变化

分别用终浓度为1、2.5、5、10μmol/L的TH588处理U266细胞48h后，置于显微镜下随机地选取多个视野来观察U266细胞形态，可观察到对照组细胞形状规则，圆形透亮，大小一致，边缘整齐，而TH588处理后的细胞密度变小，体积明显变小，形状不规则，细胞膜明显皱缩，细胞之间可见细胞碎片(图3A、B)。分别用终浓度为1、2.5、5、10μmol/L的TH588处理细胞48h后再用DAPI染色，在荧光显微镜下观察显示，对照组细胞核核型完整，形态规则，染色均匀，随着药物浓度增加，细胞核形态开始发生变化，可见部分细胞核呈现放射状和花瓣状形态(图3C、D)。这表明，用TH588处理后凋亡细胞增多。

TH588对U266细胞凋亡的影响

使用流式细胞仪检测细胞凋亡并使用Flowjo分析存活细胞，即APC与PI双阴性细胞的比例。对照组双阴性细胞比例均数为(81.93±0.35)%;TH588浓度为1μmol/L时，双阴性比例下降至(74.60±1.04)%，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01);2.5μmol/L时，双阴性比例下降至(68.53±0.98)%，差异有显著统计学意义(P<0.001);5μmol/L时，双阴性比例降至(67.33±0.24)%(P<0.001);10μmol/L时，双阴性比例下降至(65.80±0.35)%(P<0.001)。这说明，TH588能够诱导骨髓瘤细胞凋亡(图4)。

3、讨论

MM是起源于B淋巴细胞的浆细胞恶性增殖性疾病，常伴有多发性溶骨性损害、高钙血症、贫血以及肾脏损害等表现。现阶段，国内外临床上使用硼替佐米、伊沙佐米和卡非佐米等靶向药物，以及来那度胺、沙利度胺等免疫调节剂治疗MM的疗效明显优于传统治疗方案，但仍存在患者出现耐药和经济能力无法承受等情况，这就要求临床仍需探索新的靶点、新的药物[13]。

MTH1属于NUDIX家族，NUDIX水解酶能够将一个核苷二磷酸水解为单核苷酸和磷酸，目前已知的成员有20余种，包括MTH1/NUDT1、NUDT2和NUDT5等。本研究中，部分MM患者CD138+有MTH1、NUDT2、NUDT5和NUDT21高表达，由于NUDT2和NUDT21尚无相应的可应用的抑制剂，因此选择MTH1抑制剂TH588及NUDT5抑制剂TH5427作用于U266细胞。应用TH588后，MTH1表达被抑制，荧光素酶结果显示，MM细胞的荧光强度较对照组低，证明TH588对MM细胞增殖有抑制作用，而TH5427未对U266细胞产生增殖抑制的作用，故之后的研究主要围绕MTH1进行。

MTH1作为NUDIX家族中的一种水解酶，它能水解8-oxo-dGTP以及2-OH-dATP，防止其参与DNA复制，保护细胞不受损伤及衰老。因此，MTH1能够保护肿瘤细胞不会因DNA损伤而死亡。氧化应激是DNA损伤的机制之一，8-oxo-dG是ROS攻击碱基的主要产物之一[2]。肿瘤细胞MTH1表达可能是其氧化应激的标志，其持续的氧化应激比正常细胞多，意味着MTH1的表达也会较正常细胞高，从而促使癌症细胞快速增殖并损伤衰老减少。而MTH1不是正常细胞所必需的，这意味着MTH1作为一个新的治疗肿瘤的靶点是非常有意义的[11]。

研究表明，MTH1高表达与肾细胞癌的临床分期有关，肺癌、卵巢肿瘤以及乳腺肿瘤均与MTH1表达有关[6,7,9,10,14,15,16]。也有研究证明了部分MM患者晚期疾病进展以及新诊断的MM硼替佐米治疗效果差与MTH1高表达有关[2]。在多项研究中，MTH1的抑制剂TH588已被证实对癌症细胞有毒性作用，比如它可以诱导大肠癌细胞或Hela细胞在G2/M期的有丝分裂阻滞[17,18,19]。本研究结果显示，应用TH588作用于U266细胞后，MTH1表达被抑制，荧光素酶结果显示，MM细胞的荧光强度较对照组低，证明了TH588对MM细胞增殖有抑制作用，且随着药物浓度的增加，抑制作用也愈明显。根据Q-PCR结果，IL-6能调控MTH1表达升高。针对MMU266细胞株，显微镜下观察显示，应用MTH1抑制剂TH58848h即可以使U266细胞形态不规则、细胞变小、有细胞碎片产生，用药后大量细胞呈现凋亡、死亡状态;DAPI染色后荧光显微镜下可以观察到经过TH588处理的细胞核明显变小，染色不均，细胞核形态呈放射状和花瓣状，具有凋亡的特征。流式细胞仪分析结果显示，TH588应用48h后可以诱导U266细胞凋亡，使其用药后存活细胞比例下降，与对照组比较差异有统计学意义。

然而，MTH1在部分MM患者原代细胞中表达较低，其具体原因尚无法得知，且它在MM发病中的确切机制和作用尚未完全阐明[2]。TH588作为一种抑制剂对正常细胞的毒性损伤也不明确，但不能否认未来MTH1及其抑制剂在MM及其他肿瘤治疗中的意义。本研究证明了TH588可以抑制MM细胞的增殖，能够诱导其凋亡，这为之后动物模型的建立、作用机制的研究及临床上的探索奠定了一定的基础。另外，本研究还检测了其他3种NUDIX水解酶NUDT2、NUDT5和NUDT21在MM患者CD138+及CD138-中的表达，发现其在阳性细胞中也呈高表达，这为之后MM靶向治疗的研究提供了一个方向。

参考文献:

[13]樊慧守,安刚.多发性骨髓瘤靶向治疗研究进展.白血病·淋巴瘤,2019,28(5):310-314.

王欣,吴颖,张林,李宇翔,韩冰,史雪,王伟,王立生.靶向MTH1抑制多发性骨髓瘤细胞增殖和诱导凋亡的作用研究[J].中国实验血液学杂志,2020,28(05):1598-1604.