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天麻素通过Nrf2/Keapl信号通路对骨细胞分化和抑制骨质疏松的促进作用研究

2020-08-27 506 上传者：管理员

摘要：目的研究天麻素调控核因子E2相关因子2(Nrf2)/Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)信号通路促进成骨细胞分化和抑制骨质疏松的作用机制。方法将新提取的新生(出生24h内)SD大鼠颅盖骨制成的原代成骨细胞分为4组:对照组、模型组、低、高剂量实验组,低、高剂量实验组细胞预先给予1,5μmol·L-1天麻素预处理,之后和模型组一起,加入100μmol·L-1地塞米松处理;用细胞增殖/毒性检测(CCK-8)法、Hoechst33258染色法检测各组成骨细胞生物学行为;JC-1线粒体膜电位检测及ATP生成实验证实Nrf2/Keapl信号通路的作用机制;茜素红染色观察细胞成骨分化的功能性保护作用;蛋白质印迹法(Westernblot)检测线粒体凋亡途径关键蛋白、Nrf2/Keapl信号通路关键因子的表达水平。结果对照组、模型组、低、高剂量实验组原代成骨细胞的增殖率分别为(513.35±28.67)%,(231.67±15.32)%,(337.62±21.37)%和(418.14±20.96)%;凋亡率分别为(11.53±3.71)%,(77.26±10.52)%,(52.37±6.31)%和(24.91±4.69)%;原代成骨细胞的中红绿光信号比率分别为0.23±0.03,1.93±0.52,1.01±0.26和0.77±0.22;成骨结节相对形成率分别为(100.00±0.05)%,(25.00±0.05)%,(51.00±1.24)%和(65.00±3.22)%;Nrf2的表达量分别为1.07±0.08,0.51±0.03,0.78±0.04和0.92±0.08;Keap1的表达量分别为0.19±0.05,0.96±0.09,0.69±0.05和0.57±0.05;NQO1的表达量分别为0.81±0.07,0.36±0.02,0.53±0.04和0.75±0.05;HO-1的表达量分别为1.02±0.06,0.46±0.02,0.58±0.06和0.78±0.06。以上指标,低、高剂量实验组分别与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论天麻素可能通过提高原代成骨细胞增殖活性,激活Nrf2/Keapl信号通路降低线粒体氧化应激损伤,维持线粒体膜电位稳态及ATP正常生成来抑制细胞凋亡,同时促进成骨钙结节形成来促进成骨分化从而改善骨质疏松。

关键词：
分化
天麻素
成骨细胞
核因子E2相关因子2
骨质疏松
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糖皮质激素诱导性骨质疏松症是最常见的医源性及继发性骨质疏松,长时间或高浓度使用糖皮质激素患者的骨质疏松发生率在30%～50%[1]。虽然临床对糖皮质激素诱导性骨质疏松症的防范意识有所提高,但对其致病机制及防治方法的研究依旧不够。天麻素具有抗细胞凋亡、抗氧化等活性[2],但其用于骨质疏松症防治的相关研究较少。本研究旨在利用高浓度地塞米松处理诱导骨质疏松环境,并通过天麻素预处理来观察其对成骨细胞的保护作用,为天麻素用于骨质疏松的治疗提供理论依据。

材料与方法

1、材料

动物新生SD乳鼠(出生24h内),购自成都达硕,动物许可证号:SCXK(川)2015-030。

药品与试剂地塞米松、天麻素,纯度:95%,均为美国Sigma公司生产。细胞增殖毒性检测(CCK-8)试剂盒,批号20160317,日本同仁公司生产;BCA蛋白浓度测定试剂盒,批号20151109,碧云天生物技术公司生产;兔抗大鼠半胱氨酸蛋白水解酶3(Cysteine-requiringAspartateProtease,Caspase-3)、BCL2-AssociatedX的蛋白质(BCL2-AssociatedXProtein,Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcelllymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)、核因子E2相关因子2(uclearfactorerythroid2-relatedfactor2,Nrf2)、醌氧化还原酶1(quinoneoxidoreductase1,NQOI)、血红素氧合酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)、Kelch样ECH相关蛋白1(kelch-likeECH-associatedprotein1,Keap1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)单克隆抗体,英国Abcam公司生产。

仪器GF1755011全自动酶标仪,英国Anthos公司产品;CF16RXII高速冷冻离心机,日本Hitachi公司产品;MACSQuantAnalyzer10流式细胞仪,德国美天旎生物技术有限公司产品。

2、实验方法

2.1原代成骨细胞分组与处理

按照参考文献[3]方法操作。将新生乳鼠浸泡在75%乙醇中5min,无菌环境下取颅骨放置在含有D-hanks液的培养皿中,将脂肪组织及残留物清除干净后,用D-hanks液冲洗一遍并剪成1mm×1mm×1mm的小块,分别加入1mL的Ⅰ型胶原酶和0.25%的胰蛋白酶后混匀,37℃下消化10min,加入D-hanks液,吹打混匀后1400r·min-1离心10min,吸去上清后,加入10%胎牛血清后吹打均匀接种至培养瓶中,37℃的5%CO2的培养箱中培养,48h换1次液,取第3代细胞用于后续试验。

将原代成骨细胞分为对照组、模型组、低、高剂量实验组,低、高剂量实验组分别加入1,5μmol·L-1的天麻素预处理2h,之后模型组、低、高剂量实验组用100μmol·L-1地塞米松处理72h待测。

2.2检测指标

2.2.1以细胞增殖/毒性检测(CCK-8)法检测原代成骨细胞增殖活性

按照参考文献[4]方法操作。以CCK-8法检测原代成骨细胞增殖活性。根据吸光度值计算细胞活力=(药物组吸光度值/空白对照组吸光度值)×100%。

2.2.2以Hoechest33258法检测原代成骨细胞凋亡率

按照参考文献[5]方法操作。以Hoechest33258法检测原代成骨细胞凋亡率。出现细胞体积缩小、核固缩、凋亡小体形成则判断为凋亡细胞,凋亡指数=凋亡细胞数/(正常细胞数+凋亡细胞数)×100%。

2.2.3以JC-1法检测原代成骨细胞线粒体膜电位变化

按照参考文献[6]方法操作。以JC-1法检测原代成骨细胞线粒体膜电位变化。

2.2.4以茜素红染色法检测原代成骨细胞钙化情况

按照参考文献[7]方法操作。光学显微镜下观察并拍照,用ImageJ图像分析软件对成骨矿化情况进行定量分析。

2.2.5以蛋白质印迹法(Westernblot)检测原代成骨细胞中细胞凋亡及Nrf2/Keapl信号通路蛋白表达情况

按照参考文献[8]方法操作。用ImagingSystem软件分析各组条带灰度值,以目标蛋白与内参积分吸光度值比值表示蛋白的相对表达水平。

3、统计学处理

用SPSS20.0软件进行统计分析。计量资料用x¯±s表示,用单因素方差分析进行多组间比较,组间差异有统计学意义时,进一步采用SNK方法进行两两比较。

结果

1、比较各组原代成骨细胞增殖活性抑制情况

对照组、模型组、低、高剂量实验组原代成骨细胞的增殖活性指标分别为(513.35±28.67)%,(231.67±15.32)%,(337.62±21.37)%和(418.14±20.96)%,模型组和对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),低、高剂量实验组与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。

2、比较各组原代成骨细胞凋亡情况

对照组、模型组、低、高剂量实验组原代成骨细胞的凋亡率分别为(11.53±3.71)%,(77.26±10.52)%,(52.37±6.31)%和(24.91±4.69)%,模型组和对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),低、高剂量实验组与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。

3、比较各组原代成骨细胞中线粒体凋亡相关蛋白表达水平

对照组、模型组、低、高剂量实验组中cleaved-Caspase-3的表达水平分别为0.23±0.07,1.02±0.12,0.80±0.13和0.75±0.11;Bcl-2的表达量分别为1.03±0.23,0.38±0.12,0.64±0.15和0.73±0.15;Bax的表达量分别为0.19±0.06,1.09±0.16,0.73±0.14和0.65±0.11,模型组和对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),低、高剂量实验组与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见图1。

图1原代成骨细胞中线粒体凋亡途径关键蛋白表达情况

4、比较各组原代成骨细胞线粒体稳态破坏情况

对照组、模型组、低、高剂量实验组原代成骨细胞的中红绿光信号比率分别为0.23±0.03,1.93±0.52,1.01±0.26和0.77±0.22,模型组和对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),低、高剂量实验组与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。

5、比较各组原代成骨细胞分化抑制作用及Nrf-2/Keap1信号通路关键因子表达水平

对照组、模型组、低、高剂量实验组原代成骨细胞的成骨结节相对形成率分别为(100.00±0.05)%,(25.00±0.05)%,(51.00±1.24)%和(65.00±3.22)%,模型组和对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),低、高剂量实验组与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。

对照组、模型组、低、高剂量实验组原代成骨细胞的中Nrf2的表达量分别为1.07±0.08,0.51±0.03,0.78±0.04和0.92±0.08;Keap1的表达量分别为0.19±0.05,0.96±0.09,0.69±0.05和0.57±0.05;NQO1的表达量分别为0.81±0.07,0.36±0.02,0.53±0.04和0.75±0.05;HO-1的表达量分别为1.02±0.06,0.46±0.02,0.58±0.06和0.78±0.06,模型组和对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),低、高剂量实验组与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见图2。

图2原代成骨细胞Nrf2/Keap1信号途径关键蛋白表达情况

讨论

地塞米松可能通过诱导胞内活性氧簇含量升高导致线粒体膜电位受损,进而引起成骨细胞凋亡[9]。天麻素作为一种天然药物成分,具有较高的药用价值。Nrf2/Keap1是机体内调节抗氧化的主要信号通路,Keap1作为一种抑制性作用元件,机体内出现大量活性氧簇时会与Nrf2蛋白解离,激活Nrf2蛋白诱导下游的HO-1、NQO-1等抗氧化蛋白酶表达进而发挥抗氧化作用[10]。

本研究结果显示,天麻素干预能够缓解地塞米松处理引起的细胞增殖受阻及凋亡,表明天麻素具有缓解骨质疏松的效果。进一步研究发现天麻素可能是通过促进Nrf2、HO-1、NQO-1表达,抑制Keap1表达,来缓解氧化应激引起的线粒体膜电位改变,从而促进成骨细胞分化以及成骨结节形成来缓解地塞米松引起的骨质疏松。

参考文献：

[3]何帮剑,朱胤晟,应建伟,等.益骨汤含药血清通过经典Wnt信号通路促进成骨细胞增殖分化的研究[J].新中医,2017,49(3):10-13.

[4]梁伟,李理,李兵.降钙素基因相关肽对骨质疏松大鼠骨髓基质干细胞增殖及分化的影响[J].中华实验外科杂志,2018,35(1):41-45.

[7]依香叫,王松月,李金诚,等.刺老苞根皮含药血清对原代成骨细胞增殖､分化和矿化功能的影响[J].中国中医基础医学杂志,2017,23(9):1305-1307,封4.

[8]王铭,闫宇,李雅楠,等.衣霉素对转化生长因子β1刺激的肝星状细胞增殖､凋亡及caspase-9蛋白表达的影响[J].中国临床药理学杂志,2017,33(1):40-43.

[9]丁香莹,梁敏.凋亡在糖皮质激素性骨质疏松症中的研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2017,23(12):1660-1663.

尹萍秀,许闫严,刘贤莉.天麻素通过Nrf2/Keapl信号通路促进成骨细胞分化和抑制骨质疏松作用[J].中国临床药理学杂志,2020,36(16):2468-2471.

基金:湖北省卫生健康委员会科研基金资助项目(WJ2019F016)