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放疗联合二氢杨梅素对乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用研究

2020-08-27 365 上传者：管理员

摘要：目的研究二氢杨梅素联合放疗治疗对乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用及c-Jun氨基末端激酶(JNK)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的影响。方法采用背部皮下接种TM40D人乳腺癌细胞的方法建立BALB/c小鼠乳腺癌移植瘤模型,将成功构建的60只乳腺癌荷瘤小鼠随机分为模型组(n=15)、二氢杨梅素组(n=15)、放疗组(n=15)及联合组(n=15)。二氢杨梅素组小鼠给予二氢杨梅素(100mg·kg-1·d-1),灌胃,放疗组小鼠给予X线照射治疗(8Gy),联合组小鼠给予二氢杨梅素(100mg·kg-1·d-1,灌胃)联合X线照射治疗(8Gy),模型组仅灌胃等量生理盐水,不进行X线照射,连续干预4周。用酶联免疫吸附(ELISA)法检测小鼠血清雌二醇(E2)和孕酮(P)水平;测定肿瘤抑制率;用苏木精-伊红(HE)染色观察小鼠肿瘤组织病理变化;用蛋白质印迹(Wb)法检测各组小鼠肿瘤组织JNK与其下游蛋白信号传导和转录激活因子3(STAT3)蛋白表达水平。结果二氢杨梅素组、放疗组及联合组小鼠肿瘤抑制率分别为(45.86±3.37)%,(46.21±3.41)%,(69.48±4.29)%;模型组、二氢杨梅素组、放疗组及联合组小鼠血清E2水平分别为(16.37±0.58),(8.12±0.64),(8.56±0.61),(4.93±0.21)pg·mL-1,P水平分别为(206.73±8.64),(121.04±5.12),(119.87±5.16),(76.68±3.13)pg·mL-1,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论二氢杨梅素与放疗均可抑制乳腺癌荷瘤小鼠的肿瘤生长,降低雌激素水平,且二氢杨梅素联合放疗治疗的效果优于单纯二氢杨梅素或放疗,其作用机制可能与抑制肿瘤组织JNK/MAPK通路的信号转导相关。

关键词：
c-Jun氨基末端激酶
丝裂原活化蛋白激酶
乳腺癌
二氢杨梅素
放疗
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乳腺癌是一种激素依赖性肿瘤,目前手术、放疗、化疗、内分泌治疗和中医药治疗等是乳腺癌的主要治疗手段[1]。放疗在肿瘤的综合治疗中具有重要作用,可以显著提高乳腺癌存活率和局部治疗的控制率[2]。二氢杨梅素是藤茶等植物的有效成分,具有抗肿瘤、抗突变、抗炎、抗氧化及抗菌等多种药理活性,二氢杨梅素及其衍生物对SP2/0小鼠骨髓瘤细胞具有增殖抑制作用,从而控制多发性骨髓瘤的发展[3]。本研究旨在探讨二氢杨梅素联合放疗对乳腺癌的治疗作用及其可能的作用机制。

材料与方法

1、材料

动物SPF级、雌性BALB/c小鼠,4～5周龄,体重18～20g,购自上海交通大学医学院实验动物中心。动物生产许可证号:SCXK(沪)2018-0007。

细胞人乳腺癌TM40D细胞株,购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

药品与试剂二氢杨梅素,规格:20mg,批号:B20372,上海源叶生物科技有限公司生产。酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒,上海江莱生物科技有限公司生产;兔抗鼠c-Jun氨基末端激酶(JNK)抗体,美国SantaCruz公司生产;兔抗鼠信号传导和转录激活因子3(STAT3)抗体,美国CellSignaling公司生产。

仪器BX-UCB光学显微镜,日本Olympus公司产品;MicrolabSTARle酶标仪,瑞士Hamiliton公司产品;QuantityOne1-D分析软件,美国Bio-Rad公司产品。

2、实验方法

2.1实验动物模型建立[4]4]、分组及处理

采用背部皮下接种TM40D人乳腺癌细胞的方法建立BALB/c小鼠乳腺癌移植瘤模型,待移植瘤长至体积≥125mm3时,表示乳腺癌荷瘤小鼠建立成功。将成功建模的60只乳腺癌荷瘤小鼠随机分为模型组(n=15)、二氢杨梅素组(n=15)、放疗组(n=15)及联合组(n=15)。二氢杨梅素组小鼠灌胃给予二氢杨梅素100mg·kg-1·d-1,放疗组小鼠给予X线照射治疗(8Gy),联合组小鼠给予二氢杨梅素(100mg·kg-1·d-1)联合X线照射治疗(8Gy),模型组仅灌胃等量生理盐水,不进行X线照射,连续干预4周。

2.2以ELISA法检测小鼠血清雌二醇(E2)和孕酮(P)水平[5]5]

末次干预结束后,经心脏穿刺取血5mL,以1000r·min-1离心10min,取上层血清,用ELISA法检测血清E2和P水平,操作按照试剂盒说明书进行。

2.3肿瘤抑制率的测定[6]6]

采血后,颈椎脱臼法处死小鼠,剥离完整肿瘤块组织,利用分析天平称量其质量。肿瘤抑制率(%)=(模型组平均肿瘤质量-实验组平均肿瘤质量)/模型组平均肿瘤质量×100%。

2.4以苏木精-伊红(HE)染色观察小鼠肿瘤组织病理学变化[7]7]

肿瘤组织采集同2.3,将肿瘤组织切成小块后用4%多聚甲醛固定,经脱水、包埋、切片等制作石蜡切片,进行常规HE染色,光学显微镜下观察各组肿瘤组织及肿瘤细胞的病理学特点。

2.5以蛋白质印迹(Wb)法检测肿瘤组织JNK、STAT3蛋白表达[8]8]

取-80℃保存的肿瘤组织,剪碎后加入蛋白提取液,提取总蛋白,BCA法测蛋白浓度。各组取等量总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶中电泳,转膜后封闭,加入一抗JNK、STAT3和β-actin,4℃孵育过夜,加入二抗。用QuantityOne1-D分析软件进行目的蛋白的半定量分析,目的蛋白相对表达量以目标蛋白灰度值与β-actin灰度值的比值表示。

3、统计学处理

数据用SPSS21.0软件进行统计分析。计量资料用x¯±s表示,2组间比较用LSD-t检验;多组间数据比较用单因素方差分析。

结果

1、各组小鼠肿瘤抑制率比较

二氢杨梅素组、放疗组及联合组小鼠的肿瘤抑制率分别为(45.86±3.37)%,(46.21±3.41)%,(69.48±4.29)%。联合组小鼠的肿瘤抑制率明显高于二氢杨梅素组与放疗组(P<0.05)。

2、各组小鼠血清E2和P水平比较

与模型组比较,二氢杨梅素组、放疗组及联合组小鼠血清E2和P水平均显著降低,且联合组低于二氢杨梅素组、放疗组(均P<0.05),见表1。

表1各组小鼠血清雌二醇(E2)和孕酮(P)水平比较

3、各组小鼠肿瘤组织病理学变化

HE染色结果显示,模型组小鼠肿瘤组织中的肿瘤细胞排列紧密,在间质中仅可见少量的炎性细胞散在分布;二氢杨梅素组、放疗组与联合组小鼠肿瘤组织中可见肿瘤细胞数量明显减少,细胞核固缩、深染,出现较多面积大小不等的坏死区,并伴有大量的炎性细胞浸润,且上述现象以联合组的表现最明显。

4、各组小鼠肿瘤组织JNK、STAT3蛋白表达

模型组、二氢杨梅素组、放疗组及联合组小鼠肿瘤组织JNK蛋白相对表达量分别为0.94±0.06,0.56±0.11,0.61±0.13,0.07±0.05;STAT3蛋白相对表达量分别为0.89±0.11,0.65±0.09,0.63±0.12,0.14±0.06。与模型组比较,二氢杨梅素组、放疗组及联合组小鼠肿瘤组织JNK与STAT3蛋白相对表达量均显著降低,且联合组低于二氢杨梅素组与放疗组(均P<0.05)。

讨论

乳腺癌是多因素作用、多基因参与、多阶段发展的疾病,其中癌基因与抑癌基因的失衡以及信号通路传导异常在乳腺癌的发病过程中发挥重要作用。目前放疗是治疗乳腺癌的常用方法,即利用高能射线使肿瘤细胞发生坏死起到肿瘤治疗的作用。二氢杨梅素是从藤茶等植物中提取的一种二氢黄酮醇化合物,可抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞周期阻滞与凋亡等,具有显著的抗肿瘤作用[9]。研究显示,二氢杨梅素可有效抑制乳腺癌荷瘤小鼠的肿瘤生长,且无心、肝、肾毒性[10]。本研究中,联合组小鼠肿瘤抑制率高于二氢杨梅素组与放疗组,二氢杨梅素组、放疗组及联合组小鼠血清E2、P水平低于模型组,提示二氢杨梅素与放疗均可抑制乳腺癌荷瘤小鼠的肿瘤生长,降低雌激素水平。

JNK是MAPK信号通路中最为重要的信号通路,JNK的激活可促进乳腺癌细胞增殖;STAT3为JNK/MAPK通路下游的重要蛋白,激活后也可促进乳腺癌细胞增殖[11,12]。研究显示,通过RNA干扰抑制小分子糖蛋白丝甘蛋白聚糖表达后可诱导乳腺癌细胞凋亡,并下调JAK/STAT通路中蛋白的表达[13]。本研究中,二氢杨梅素组、放疗组及联合组小鼠肿瘤组织JNK与STAT3蛋白相对表达量均低于模型组,且联合组低于二氢杨梅素组、放疗组,表明二氢杨梅素与放疗均可下调乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤组织JNK、STAT3蛋白,抑制JNK/MAPK通路的信号转导,从而抑制乳腺癌细胞增殖,且二氢杨梅素联合放疗治疗效果更佳。

参考文献：

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