在我国头颈恶性肿瘤中,喉鳞状细胞癌的发病率仅次于鼻咽癌[1],其主要治疗方式包括手术和放化疗。虽然随着新技术的应用,患者的生存率有所提高,但手术和放化疗的并发症严重影响了患者的生存质量。精准的分子靶向治疗是挽救恶性肿瘤患者生命并提高生存质量最有效的方式之一[2],因此,我们希望找到能够在LSCC治疗中发挥关键作用的分子。研究证实,微小RNA(microRNA)通过与靶基因mRNA的3’端非翻译区(3’-UTR)结合,对mRNA进行切断或者抑制靶基因的转录后翻译,从而发挥生物学作用。microRNA(miRNA)在恶性肿瘤的起病、进展、转移等过程中发挥着重要作用,并且有望成为肿瘤诊断和治疗的潜在靶点。我们之前的研究发现[3],电压门控式钙通道蛋白α2δ1具有成为喉癌肿瘤干细胞(cancerstemcell,CSC)标志物的潜质,α2δ1具有促进喉癌细胞成球、侵袭、体内成瘤等作用。而通过生物信息学分析发现,miRNA-107(miR-107)具有与α2δ1编码基因CACNA2D1的mRNA3’-UTR潜在结合的位点,并且miR-107在多数恶性肿瘤中发挥着抑癌作用,但miR-107与CACNA2D1在LSCC中的相互作用关系目前研究甚少。因此,我们希望通过实验,检测miR-107和CACNA2D1在LSCC组织中的表达情况,同时通过细胞实验分析它们之间是否存在靶向调节作用。

1、资料与方法

1.1临床资料

收集2014-01-2017-08在北京友谊医院行喉癌手术的40例患者的组织标本,每位患者均同时取喉癌组织和癌旁正常组织(距肿瘤边缘至少2cm)。所有标本均在离体后2min内放入液氮保存,所有癌组织经病理学检查证实为LSCC,癌旁正常组织未见癌细胞。患者均为男性,年龄48～74岁,平均61.1岁。均为第1次手术,术前未行放疗、化疗等辅助治疗。病理证实颈淋巴结转移者14例,无淋巴结转移26例;低分化6例,中高分化34例;Ⅰ～Ⅱ期10例,Ⅲ～Ⅳ期30例;声门型27例,声门上型+声门下型13例。本研究通过了北京友谊医院伦理委员会的批准。

1.2材料

人喉癌细胞株TU212和TU686购自上海慧颖生物科技有限公司;胎牛血清、DMEM培养液、Opti-MEM培养液、双抗、0.25%胰蛋白酶、OPTI-MEM购自Gibco;LipofectamineTM2000、Trizol购自美国Invitrogen;MTT购自美国Sigma公司;SYBRGreenMasterMix、HiScriptReverseTranscriptase(RNaseH)购自南京诺唯赞公司;miR-107模拟物(agomiR-107)、miR-107抑制剂(antagomiR-107)以及相应阴性对照(agomiR-107NC,antagomiR-107NC)由上海吉玛公司合成;Transwell购自BDBiosciences;CACNA2D1单克隆抗体和微量移液器购自ThermoFisher公司;倒置显微镜购自日本Olympus公司;TaqPlusDNAPolymerase、DL2000DNAMarker、dNTP购自天根公司;双荧光素酶检测试剂盒(#RG027)购自碧云天生物技术有限公司;miR-107和CACNA2D1特异性引物、内参U6和GAPDH引物由北京天一辉远公司合成,引物序列见表1。

表1各基因引物

1.3方法

1.3.1细胞培养

将TU212和TU686细胞从液氮中取出,快速放入37℃水浴锅中,把解冻后的细胞转移到含有5mL培养液的离心管中,离心收集细胞,室温1200r/min离心3min,弃上清;用完全培养液(DMEM+10%FBS+1%双抗)悬浮细胞,接种到培养皿中,吹打混匀,37℃5%CO2饱和湿度条件下培养。取对数期生长良好的细胞用于实验。

1.3.2实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)

使用Trizol法分别提取收集喉癌组织及癌旁正常组织中的总RNA,对A260/A280在1.8～2.0之间的RNA标本进行逆转录,利用HiScript逆转录试剂盒将总RNA逆转录出miR-107/CACNA2D1和U6/GAPDH(作内参)的cDNA,反应条件:25℃5min,50℃15min,85℃5min,4℃10min。然后使用SYBRGreenMasterMix试剂盒按照说明书进行qRT-PCR,反应系统(共20μL)包括以下物质:SYBRGreenMasterMix(10μL),正向引物(0.4μL,10μmol/L),反向引物(0.4μL,10μmol/L),cDNA(4μL,稀释比例1:10),50xROX参考染料2(0.4μL)和蒸馏去离子水(4.8μL)。反应条件:50℃2min,95℃10min;95℃30s,60℃30s,40cycles。所有实验重复3次。运用2-△△Ct分析相应基因的相对表达水平,重复3次。

1.3.3蛋白免疫印迹

用放射免疫沉淀缓冲液提取喉癌及正常组织中的总蛋白。以GADPH为内参,按说明书使用BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度,根据OD值利用回归方程计算出样品蛋白浓度。在变性条件下,通过12%十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质样品(40μg/孔),并使用湿转移法转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。转膜条件为:GAPDH-200mA90min,CACNA2D1-200mA,120min后300mA30min。将PVDF膜浸入含有5%脱脂奶的TBST中,在室温下封闭2h,然后与CACNA2D1单克隆抗体(1:500)一起孵育,兔抗GAPDH(1:1000)抗体在4℃过夜。用TBST将PVDF膜清洗5～6次,每次5min。然后清洗印迹,并与HRP标记的山羊抗小鼠二抗(1:50000)孵育2h。用TBST洗涤后,将ECL底物溶液与稳定的过氧化物酶溶液以1:1的比例混合,然后将其添加到PVDF膜中。使用UVP图像分析系统检测免疫反应带,使用BandScan5.0软件估计目标蛋白α2δ1的表达水平。

1.3.4细胞转染

将处于对数生长期的TU212和TU686细胞按每孔5×105个细胞均匀地接种到6孔板中,培养至70%密度。转染前2h换成无血清培养液。转染分组分为agomiRNC组,agomiR-107组,antagomiRNC组,antagomiR-107组,同时设置空白对照组。转染组均按下面的方法准备:用100μL无血清opti-MEM稀释10μL小片段,取5μL的LipofectamineTM2000稀释在100μLopti-MEM中,混合LipofectamineTM2000和小片段混合物稀释液(总体积为200μL),混匀静置20min;每个培养孔加转染复合物混合液200μL,混匀后于37℃、5%CO2培养箱中培养,4h后吸出混合液换入正常培养液,继续培养24h。

1.3.5预测靶点及双荧光素酶报告基因实验

使用TargetScan,PicTar和miRDB在线软件预测,发现miR-107与CACNA2D1的3’-UTR保守区域具有2个潜在的结合位点(202-209,902-908)。为了构建萤光素酶报道载体,扩增了覆盖目标基因CACNA2D1上假定的hsa-miR-107结合位点的3’-UTR片段。引物序列如下:正向:5’-GGTTCTTTTCCAACGCTATT-3’;反向:5’-GACTCATTTAGATCCTCACAC-3’。通过DNA测序验证所有构建体。萤光素酶报告基因实验在TU686细胞系中进行。转染前1天,将细胞以2×105个细胞/孔的密度接种到12孔板中,然后接种pYr-MirTarget-homoCACNA2D13’-UTR(202-209,2μg)和pYr-MirTarget-homoCACNA2D13’-UTR(902-908,2μg)与agomiR-107(0.1nmol/L),agomiRNC(0.1nmol/L),antagomiR-107(0.1nmol/L)或antagomiRNC(0.1nmol/L)共转染。转染48h后,使用双荧光素酶检测试剂盒测量相对荧光素酶活性。还同时构建了2个与CACNA2D13’-UTR中的2个种子区域有关的突变载体,第1个载体是pYr-MirTarget-homoCACNA2D13’-UTR202-209mut,第2个载体是pYr-MirTarget-homoCACNA2D13’-UTR902-908mut。转染和萤光素酶测定程序与上述类似,重复3次。

1.3.6细胞增殖实验(MTT)

转染后,将细胞分为空白对照组,agomiRNC组,agomiR-107组,antagomiRNC组和antagomiR-107组。将转染的细胞以5×103个细胞接种到96孔板中,每组有3个重复孔。向每个孔中加入10μLMTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐],37℃孵育4h,吸出培养液,并将细胞与150μLDMSO孵育10min。使用酶标仪在490nm处测量吸光度,重复3次。

1.3.7细胞克隆形成实验

稀释经转染后的细胞悬液,并将每组以250个细胞/孔的细胞密度接种在6孔板中,每组3个重复孔,孵育2周。当观察到有宏观克隆形成时,进行结晶紫染色30min。用显微镜拍摄并计数菌落数。

1.3.8细胞侵袭实验

取上述转染后的TU212及TU686细胞,稀释细胞浓度至2×105/ml。在24孔板中加入800μL10%FBSDMEM培养液(含双抗),在transwell小室上室底部中央垂直加入100μL终浓度为1mg/mL的Matrigel,37℃温育4～5h使其干成胶状,待Matrigel干成胶状后,在transwell上室分别接入200μL各组细胞悬液,37℃、5%CO2培养箱培养48h;取出transwell用PBS清洗,用70%冰乙醇溶液固定细胞1h;用0.5%结晶紫染液染色,室温中放置20min,PBS清洗,用干净的棉球将上室一侧的未侵袭的细胞擦干净,显微镜下观察拍照计数。

1.4统计学处理

采用GraphPadPrism6和SPSS19.0软件进行统计学分析。使用ImageJ软件对蛋白免疫印迹(WesternBlot,WB)条带、增殖及侵袭能力的结果进行分析。所有计量资料数据均进行正态分布检验和方差齐性检验,符合正态分布的数据采用x¯±s表示,两组间样本均数的比较采用Student'st检验,多组间计量资料的比较采用One-WayANOVA检验,符合非正态分布的变量表示为中位数±四分位数。正态分布采用Kolmogorov-Smirnov(KS)方法检测。对于符合正态分布且方差齐的数据,不满足方差齐性的数据采用Welch’sANOVA检验。通过独立t检验分析两组间数据的统计学差异,采用析因分析多组间差异及组内差异的比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1qRT-PCR检测结果

通过图1可以看出,与癌旁正常组织相比,喉癌组织中的CACNA2D1相对表达水平明显升高,而miR-107相对表达水平明显降低,两者相比差异有统计学意义(P<0.05)。

图1CACNA2D1和miR-107在2种组织中的相对表达水平比较

2.2WB检测结果

通过WB相对定量检测可以看出,在喉癌组织中α2δ1蛋白的相对表达水平较癌旁正常组织明显增高(图2),差异有统计学意义(P<0.05)。

图2WB检测LSCC患者喉癌组织与癌旁正常组织中α2δ1蛋白相对表达情况

2.3miR-107的转染率

使用agomiRNC,agomiR-107,antagomiRNC或antagomiR-107分别转染TU212和TU686细胞后,qRT-PCR检测显示,agomiR-107组中的miR-107显著增加,而antagomiR-107组中的miR-107相对表达水平则显著下降(图3),与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。证实细胞转染是成功的,这为下一步细胞学实验奠定了良好的基础。

图3qRT-PCR检测结果

2.4双荧光素酶报告基因检测结果

通过软件预测在CACNA2D1的3’-UTR保守区域中有2个潜在的miR-107结合位点(位点A:202-209,位点B:902-908),将包含CACNA2D1野生型或突变型3’-UTR的报告基因表达载体克隆到荧光素酶基因的下游(图4a,c),进行双荧光素酶报告基因检测。在位点A(图4b),agomiR-107使荧光素酶活性降低了55.6%(P<0.05),在位点B(图4d),agomiR-107使荧光素酶活性降低了80.6%(P<0.05),agomiR-107在A点的抑制作用弱于在B点;此外,antagomiR-107在2个结合位点均增强了萤光素酶活性(均P<0.05)。结果表明,miR-107可以直接靶向抑制CACNA2D1。

图4双荧光素酶报告基因检测

2.5miR-107抑制了喉癌细胞的增殖率

MTT实验证实,将agomiR-107,antagomiR-107和相应的阴性对照转染到2个细胞系后,2个细胞系的增殖率受到显著影响。与空白对照组相比,agomiR-107组的TU212细胞增殖率降低了30.1%(P<0.05),而antagomiR-107组的TU212细胞增殖率提高了130.3%(P<0.05),见图5a。TU686细胞实验结果类似,agomiR-107组的增殖率降低了38.4%(P<0.05),而antagomiR-107组的增殖率提高了138.9%(P<0.05),见图5b。结果表明,miR-107显著抑制了LSCC细胞的增殖。

2.6miR-107抑制喉癌细胞克隆形成能力

TU212和TU686细胞克隆形成实验结果表明,2个LSCC细胞系中agomiR-107组的克隆数显著低于空白对照组(P<0.05),并且在antagomiR-107组中形成的克隆数高于空白对照组(P<0.05),见图6。说明miR-107可以抑制LSCC细胞中克隆的形成。

2.7miR-107抑制喉癌细胞的侵袭

细胞侵袭实验结果证实,转染agomiR-107、antagomiR-107和相应的阴性对照后,与对应的空白对照组比较,agomiR-107组TU212和TU686细胞的侵袭细胞数明显减少(P<0.05),而antagomiR-107组的侵袭细胞数明显增加(P<0.05),见图7。结果表明miR-107能够显著抑制LSCC细胞的侵袭。

3、讨论

在恶性肿瘤的治疗探索中,除了常规的手术和放化疗之外,目前已有多种分子靶向治疗的药物面世并且取得了良好的效果,但这些靶向药物针对LSCC的治疗效果尚不理想,问题的关键在于尚未找到一个确切的靶点。CSC学说已经被学者所公认[4],它是指肿瘤中的一小群特殊的细胞,通过自我更新和无限增殖维持肿瘤细胞群的生命力,因此,精确找到CSC并且对其进行有针对性的攻击是肿瘤精准治疗的核心内容。有学者证实电压门控钙通道亚基α2δ1蛋白具有成为肝癌[5]、胃癌[6]、肺癌[7]等肿瘤的CSC标志物的潜质,α2δ1+细胞在肿瘤的分化、自我更新、药物抵抗、放射耐受、成瘤等方面明显强于α2δ1-细胞,我们之前的研究也证实了α2δ1在LSCC中具有类似的作用[3]。本课题我们首先进行了组织学实验,WB证实了α2δ1在喉癌组织中明显高表达(P<0.05),提示α2δ1很可能在喉癌的发病、进展等方面发挥相关作用。α2δ1通过控制肿瘤细胞的自发性钙震荡,从而实现自我更新、致瘤性以及存活[8]。从理论上推测,找到抑制或消灭α2δ1+细胞的分子,即有可能更彻底地清除肿瘤,从而对肿瘤治疗提供极大的帮助。

图5miR-107抑制LSCC细胞的增殖率

图62种LSCC细胞的克隆形成实验结果

miRNAs是一类内源性的短链非编码RNA家族,是由19～24个核苷酸组成的内源非编码单链小RNA,miRNA通过与靶基因mRNA的3’-UTRs的不完全碱基配对形成RNA诱导沉默复合体对mRNA稳定性或者翻译起负调节作用,调节体内约1/3的基因。miRNAs表达水平与原发肿瘤的侵袭范围、病理分型、分化程度、淋巴结转移、外科治疗和放化疗的治疗效果及术后生存时间均密切相关[9]。miRNA也被证明是充满前景的生物标志物和合适的治疗靶点。本研究想证实miRNA家族是否能够抑制α2δ1的编码基因CACNA2D1从而发挥抑制肿瘤细胞恶性特质的作用。

图75组喉癌细胞间侵袭能力比较

我们首先通过多个在线数据库(TargetScan,PicTar和miRDB)进行预测,发现CACNA2D1的mRNA3’-UTR有2个位点可能与miR-107结合,故初步决定将miR-107确定为我们的研究对象。在神经胶质瘤[10]、肺癌[11]、肝癌[12]等恶性肿瘤的研究中发现,miR-107扮演着“抑癌者”的角色,其在肿瘤组织中低表达,过表达miR-107可使肿瘤细胞的迁移、侵袭、增殖、耐药等特性受到抑制;但在胃癌[13]、胰腺癌[14]等恶性肿瘤中,miR-107却是作为一种“促癌基因”而存在。因此miR-107是通过调控不同的基因从而发挥“促癌”或者“抑癌”的作用。我们通过喉癌组织qPCR发现,miR-107与CACNA2D1表达呈负相关,提示miR-107有可能直接抑制CACNA2D1基因从而发挥作用。

我们紧接着进行了双荧光素酶报告基因实验,试图证实miR-107与CACNA2D1存在结合位点,结果也证实了我们的预测,并且,miR-107与CACNA2D1的3’-UTR的2个潜在结合点(202-209,902-908)均能够结合,并抑制了CACNA2D1的转录后翻译。本研究结果显示,在902-908这个结合位点结合后荧光素酶活性降低了80.6%,较202-209这个位点的抑制作用更强。由此我们推测,既然在我们前期的研究中已经证实了α2δ1具有促进肿瘤细胞恶性特质的作用[3],那么miR-107与α2δ1蛋白的编码基因CACNA2D1结合后,是否能够起到抑制肿瘤细胞增殖、克隆形成或者侵袭能力的作用?

为了证实miR-107在LSCC中发挥抑癌作用,我们进行了几项典型的细胞学实验。使用了2种LSCC细胞系,其中TU212的恶性程度较TU686高。在MTT细胞增殖实验中发现,antagomiR-107组的细胞增殖率明显高于空白对照组,而agomiR-107组则明显低于白空对照组,说明miR-107确实能够明显抑制LSCC的增殖。与之类似的是,在进一步实验中也显示,miR-107能显著抑制LSCC细胞的克隆形成和侵袭,表明miR-107在LSCC细胞中发挥抑癌的作用,这与其他恶性肿瘤的结果是一致的[10,11,12]。结合双荧光素酶报告基因的结果可以看出,miR-107通过直接靶向调节CACNA2D1基因从而抑制LSCC细胞的增殖、克隆形成及侵袭能力。

本研究证实了在喉癌组织中miR-107与CACNA2D1基因的表达存在负相关性,并且,miR-107作为上游基因,能直接靶向调控CACNA2D1,同时抑制LSCC细胞的恶性特质。但我们尚未进行裸鼠体内成瘤实验,还没有在动物模型体内证实miR-107能在体内抑制LSCC的发生和进展,故需继续设计更多的实验去进一步验证以上结果。总之,miR-107具有成为抑制LSCC的分子之一,CACNA2D1有可能成为未来研究LSCC发病及治疗的一个靶点。

黄朝平,王轶,黄石,王振晓,刘良发.microRNA-107通过靶向调节CACNA2D1抑制喉癌细胞的增殖和侵袭能力[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2020,34(10):911-918.