缺血性脑卒中又称中风，其发病原因多为血管阻塞，当阻塞的血管恢复血流通畅后，反而使脑组织的损伤加重，称之为脑缺血再灌注损伤（cerebralischemiareperfusioninjury,CIRI）。近年来，脑卒中在我国患病群体中占比逐年上升，是导致死亡和残疾的重要原因之一[1]，而患有高血压、高血脂等基础疾病的人群更易发生脑卒中，CIRI是缺血性脑卒中发展过程中的一个病理过程，是影响缺血性脑卒中的预后和转归的重要因素之一[2]。松龄血脉康胶囊是临床常用药物，可以治疗高血压、高血脂等病，且疗效显著[3]。已有研究[4]表明，松龄血脉康胶囊可以减少CIRI后神经元细胞凋亡的发生，但其具体分子机制并不清楚。CIRI的病理机制包括线粒体能量代谢障碍、氧化应激、细胞凋亡等，其中细胞凋亡是CIRI的重要机制之一[5]。细胞凋亡通路包括外源性死亡受体途径、线粒体途径和内质网途径3条，其中内质网途径是细胞凋亡的重要通路[6]。本研究拟在CIRI动物模型中探讨松龄血脉康胶囊是否通过抑制内质网应激（endoplasmicreticulumstress,ERS）细胞凋亡信号通路治疗CIRI，从而保护大脑神经细胞，以期为松龄血脉康胶囊在脑血管病中的临床应用提供科学依据。

1、材料与方法

1.1实验动物

SPF级雄性SD大鼠50只，体质量（250～280)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SYXK（京）2016-0006，动物使用许可证号：SYXK(京)2020-0013。动物饲养于北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部和北京市重点实验室动物房（SPF级），符合动物伦理审查要求。

1.2试剂及仪器

松龄血脉康胶囊（批号：1901007，国药准字Z10960023，成都康弘制药有限公司）；依达拉奉注射液（批号：80-190907，国药准字H20031342，南京先声东元制药有限公司）；CHOP（批号：L63F7）、CleavedCaspase-3（批号：Asp175）购自美国CST公司；Caspase-12（批号：ab62484）、GAPDH（批号：ab181602）、β-actin（批号：ab3280）购自美国Abcam公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（批号：G3250，美国Promega生物公司）；全蛋白提取试剂盒（批号：KGP250，江苏凯基技术生物有限公司）；DeadEndTMTUNEL荧光染色试剂盒（批号：G3250，美国Promega生物公司）；裂解液（批号：P0013B，碧云天生物技术公司）；PAGE胶（批号：PG113，上海雅酶生物科技有限公司）；Western封闭液（批号：P0252，碧云天生物技术公司）；羊抗兔二抗（批号：RS0002，美国ImmunoWayBiotechnology公司）。

酶标仪（型号：RT-6000，深圳Rayto公司）；自动错步分析仪（型号：BIO-FMA，美国HarvardApparatus公司）；凝胶成像仪（型号：Tanon4600，北京原平皓生物技术有限公司）。

1.3动物模型制备

雄性SD大鼠适应性喂养至体质量250～280g后，禁食12h，常规给水，1%戊巴比妥钠腹腔注射（5mL/kg体质量）进行麻醉，仰卧位固定于鼠板，线栓法制备右侧大鼠大脑中动脉栓塞模型（middlecerebralarteryocclusion,MCAO），栓线直径0.26mm，遇到阻碍即停止，插入深度约2cm，缺血1.5h后拔出栓线。假手术组大鼠仅分离血管，不插入线栓。在手术结束24h后对大鼠进行Zea-Longa's评分[7]，得分为1～3分则可入组，余舍弃不用。

1.4动物分组与干预

从50只雄性SD大鼠中随机选取11只为假手术组，其余大鼠采用右侧大脑中动脉栓塞法制备CIRI模型，造模成功的33只大鼠随机分为模型组、松龄血脉康组及依达拉奉组，每组11只。假手术组及模型组大鼠灌胃蒸馏水10mL/（kg·d）；松龄血脉康组灌胃松龄血脉康胶囊溶液10mL/（kg·d）（溶液浓度：47.25mg/mL）；依达拉奉组腹腔注射依达拉奉注射液3.15mL/（kg·d）（溶液浓度：2mg/mL）。干预5d后进行检测并取材。

1.5各组大鼠Garcia改良神经功能评分

在MCAO术后24h及药物干预5d后，根据Garcia[8]改良神经功能评分标准对大鼠进行评分，具体评分细则包括自发活动、前肢运动、攀爬能力、躯体感觉、胡须刺激以及平衡木实验。每组大鼠记录造模24h及造模5d后的评分，并进行统计。

1.6错步实验观察大鼠错步次数

各组大鼠干预5d后进行错步实验[9]。将大鼠放入错步仪的起始位置，使其跑向终点，在此过程中软件监测并记录大鼠的错步次数。大鼠的四肢或尾巴低于错步仪中的踏板以下的位置时，电脑自动记录一次错步。为减少误差，错步仪中前10个踏板不计算在内。

1.7HE染色法观察大鼠脑组织形态结构

大鼠脑组织灌流后进行组织固定，48h后脱水、包埋、切片（厚度为5μm）。二甲苯脱蜡，梯度浓度酒精下行水化，采用苏木精-伊红（HE）染液进行胞核和胞质染色，梯度浓度酒精上行脱水，二甲苯透明并滴加中性树脂胶封片，在显微镜下进行观察并拍照。

1.8TUNEL染色法检测大鼠脑组织细胞凋亡

根据试剂盒操作说明，将大鼠脑组织石蜡切片脱蜡、水化，组织固定于室温30min，用PBS进行清洗，滴加蛋白酶K工作液（100μL/片）室温孵育10min进行消化，PBS清洗后再次室温固定5min。PBS清洗后，滴加EquilibrationBuffer液（100μL/片）室温孵育10min用于反应前平衡，吸去EquilibrationBuffer液，滴加含荧光标记底物的末端DNA转移酶反应混合液（50μL/片），37℃避光孵育60min,2×SSC溶液清洗，最后滴加内含DAPI成分的抗荧光衰减封片剂（10μL/片）封片。在荧光显微镜下观测，每张切片随机选择10个脑组织缺血区，在400倍镜视野下进行拍照，用ImageJ软件对凋亡细胞数量进行统计，细胞凋亡率=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.9Westernblot法检测各组大鼠脑组织的CleavedCaspase-3、CHOP、Caspase-12蛋白表达

取大鼠缺血区脑组织50mg，加入其10倍体积的裂解液进行蛋白提取，蛋白浓度的测定采用BCA法，并将其浓度全部调整为4μg/μL，分装冻存于-80℃冰箱备用。采用快速凝胶法制备12.5%的PAGE胶，电泳将不同分子量的蛋白分离（上样量：40μg），并将其转移至孔径为0.22μm的NC膜，采用Western封闭液室温封闭1h后分别加入一抗CleavedCaspase-3、CHOP、Caspase-12（比例均为1∶1000）及GAPDH(1∶10000）、β-actin(1∶20000），将加入一抗的NC膜存放于4℃冰箱孵育过夜，次日回收一抗，清洗后加入羊抗兔二抗（1∶20000）室温孵育1h，洗涤后在暗环境中滴加发光液并使用凝胶成像仪记录，ImageJ软件分析条带相对灰度值，β-actin或GAPDH为内参。

1.10统计学方法

实验数据通过SPSS20.0软件进行统计分析，数据结果用“”表示。符合正态分布且方差齐的数据，采用单因素方差分析，组间两两比较采取LSD检验进行；符合正态分布但方差不齐的数据，组间比较则采用单因素方差分析中DunnettT3检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1各组大鼠神经功能评分比较

造模24h后，假手术组神经功能评分为22分，模型组、松龄血脉康组及依达拉奉组评分均低于假手术组，差异有统计学意义（P<0.01），表示造模成功。造模5d后，模型组、松龄血脉康组与依达拉奉组神经功能评分仍低于假手术组，差异有统计学意义（P<0.01,P<0.05）；松龄血脉康组与依达拉奉组神经功能评分显著高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。与造模24h后比较，假手术组及模型组在造模5d后的评分无显著差异（P>0.05）；松龄血脉康组及依达拉奉组神经功能评分显著高于造模24h后评分，差异有统计学意义（P<0.01,P<0.05）。见表1。

表1各组大鼠神经功能评分

2.2各组大鼠错步实验结果比较

与假手术组比较，模型组、松龄血脉康组及依达拉奉组大鼠的错步次数显著增加，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，松龄血脉康组及依达拉奉组大鼠错步次数显著减少，差异有统计学意义（P<0.01）；松龄血脉康组与依达拉奉组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2各组大鼠错步实验结果比较

2.3HE染色观察各组大鼠脑组织形态结构改变

假手术组大脑皮层神经元细胞形态完整、结构正常、胞核清晰，胞质充盈，细胞排列整齐；模型组大脑皮层神经元细胞皱缩，染色质色深浓，胞核与胞质无明显分界，部分细胞呈空泡状改变；与模型组比较，松龄血脉康组及依达拉奉组大脑皮层神经元细胞皱缩减少、细胞形态及结构明显改善。见图1。

图1各组大鼠大脑HE染色结果

2.4TUNEL染色观察各组大鼠脑组织细胞凋亡情况

假手术组无阳性细胞染色；与假手术组相比，模型组、松龄血脉康组及依达拉奉组阳性细胞百分比显著增加，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组相比，松龄血脉康组及依达拉奉组阳性细胞百分比显著减少，差异有统计学意义（P<0.01）；与依达拉奉组相比，松龄血脉康组阳性细胞百分比显著减少，差异有统计学意义（P<0.01）。见图2、表3。

图2各组大鼠大脑TUNEL染色结果

2.5各组大鼠脑组织调亡蛋白CleavedCaspase-3及ERS促凋亡蛋白CHOP和Caspase-12的表达

与假手术组相比，模型组、松龄血脉康组及依达拉奉组CleavedCaspase-3与CHOP、Caspase-12相对蛋白表达量显著增高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组相比，松龄血脉康组及依达拉奉组CleavedCaspase-3及CHOP、Caspase-12相对蛋白表达量明显减少，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；与依达拉奉组相比，松龄血脉康组CleavedCaspase-3及CHOP、Caspase-12相对蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图3、表4。

表3各组大鼠大脑TUNEL染色细胞凋亡百分比结果

图3各组大鼠脑组织CleavedCaspase-3及CHOP、Caspase-12相对蛋白表达条带图

表4各组大鼠脑组织CleavedCaspase-3及CHOP、Caspase-12相对蛋白表达

3、讨论

松龄血脉康胶囊成分为鲜松叶、珍珠层粉、葛根；鲜松叶具有祛风燥湿、活血安神等作用。《本草汇言》记载松毛能治“大风癞疾”；珍珠层粉具有重镇平肝、清热凉血等作用，《本草汇言》记录珍珠层粉“镇心，定志”；葛根具有解肌生津、升阳止泻等作用，是阳明经引经药，《本草正》记录葛根“凡热而兼渴者，此为最良”；三药相伍，共奏平肝潜阳息风、镇心安神之效。CIRI的中医病机为肝阳上亢，气血逆乱，上犯于脑，因此，从中医学理论角度而言，松龄血脉康可以治疗CIRI。目前的研究[10,11,12]表明，鲜松叶、葛根及珍珠层粉均具有抗氧化应激的作用。CIRI时会产生大量活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS），发生脂质过氧化反应，破坏内质网的Ca2+稳态，从而诱发ERS介导的细胞凋亡[13]。因此，推测松龄血脉康可以通过减轻ERS改善CIRI。依达拉奉注射液具有抗ERS凋亡、清除氧自由基的作用，在CIRI中发挥神经保护作用[14]，故作为本研究的阳性对照组。

缺血性脑卒中急性期血管再通后，脑组织缺血区的半暗带受到再灌注损伤，而细胞凋亡是CIRI的重要机制之一[15,16]。CIRI的治疗旨在减少细胞凋亡，减轻组织灌注不足带来的影响，挽救缺血半暗带，促进神经功能恢复等[17]。在本研究中，造模24h后模型组大鼠神经功能评分较低（P<0.01），且与造模5d后相比，其神经功能无显著差异；松龄血脉康组与依达拉奉组在干预5d后神经功能评分显著高于模型组（P<0.05），并且分别高于本组造模24h后评分（P<0.01,P<0.05），同时，松龄血脉康组与依达拉奉组神经功能评分无显著差异。表明松龄血脉康胶囊及依达拉奉注射液可以改善CIRI后大鼠的神经功能，并且松龄血脉康胶囊和依达拉奉注射液的效果相当。错步实验可以检测大鼠共济失调情况，模型组大鼠错步次数显著增加（P<0.01），经过松龄血脉康胶囊与依达拉奉注射液治疗后其错步次数显著减少（P<0.01），说明松龄血脉康胶囊可以改善CIRI大鼠共济失调，并且和依达拉奉注射液效果相当。HE染色中，经过松龄血脉康胶囊和依达拉奉注射液治疗后神经元细胞形态结构较模型组改善。以上研究表明松龄血脉康胶囊可以改善大鼠CIRI缺血区神经元细胞形态结构，具有神经保护作用。

已有研究[18]表明，ERS是CIRI细胞凋亡信号通路的关键组成部分。内质网是蛋白质合成的重要场所，并且参与钙离子稳态调节、脂质和葡萄糖代谢[19]。当CIRI发生时，内质网的稳态被破坏，产生ERS，导致蛋白质合成障碍而使错误折叠蛋白产生并积聚，从而激活未折叠蛋白反应（unfoldedproteinresponse,UPR），最初UPR的激活可以帮助重建内质网稳态并使内质网功能恢复正常，但是持久而严重的CIRI激活ERS凋亡通路发生细胞凋亡[20]。CHOP是ERS信号通路下游重要的促凋亡因子，参与内质网介导的细胞凋亡[21]。现有研究[22]表明CHOP基因沉默可以减轻ERS诱导的细胞凋亡。CHOP蛋白的表达可通过ERS信号通路PERK-elF2-ATF4及IRE1aJNK调节，ERS激活PERK及IRE1a，增加CHOP蛋白的表达，调节Bcl-2蛋白及Bax蛋白的表达并且启动Caspase凋亡信号通路发生细胞凋亡[23]。Caspase-12是ERS凋亡通路中另一个重要的蛋白，存在于内质网膜中，通常以无活性的前体形式存在。已有的研究[24]证明ERS介导的细胞凋亡可以通过抑制Caspase-12蛋白表达而减轻。ERS可以激活IRE1，活化的IRE1激活Caspase-12，启动内质网介导的细胞凋亡[25]。Caspase-12活化并裂解Caspase-9，后者进一步活化裂解Caspase-3，最终导致细胞凋亡。在本研究中，模型组CleavedCaspase-3与CHOP、Caspase-12相对蛋白表达量显著增高（P<0.01），而经松龄血脉康胶囊及依达拉奉注射液干预5d后，其蛋白表达量显著减少（P<0.05或P<0.01）。并且TUNEL染色显示模型组阳性细胞百分比显著增加（P<0.01），而经松龄血脉康胶囊及依达拉奉注射液干预5d后其阳性细胞百分比显著减少（P<0.01），且松龄血脉康组比依达拉奉组细胞凋亡百分比低（P<0.01）。以上结果表明松龄血脉康胶囊可以减少ERS引起的细胞凋亡，并且其对细胞凋亡的作用与依达拉奉注射液相仿。因此，推测松龄血脉康胶囊可能是通过降低ERS特异的促凋亡蛋白CHOP、Caspase-12的表达水平减少细胞凋亡，减轻CIRI，发挥神经保护作用。

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文章来源：马喆,王思锦,高永红,程炜婷,巩卓彦,孙逸坤,薛程元,金秋硕,高颖,娄利霞.松龄血脉康胶囊对大鼠脑缺血再灌注损伤内质网应激凋亡相关蛋白的影响[J].湖南中医药大学学报,2021,41(05):685-690.

基金：国家自然科学基金面上项目(81473660);国家自然科学基金青年项目(81403366)