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肺癌小鼠体内肿瘤生长转移受不同分子量透明质酸的影响

2020-07-16 567 上传者：管理员

摘要：目的观察皮下注射不同分子量透明质酸(HA)对LLC肺癌模型小鼠体内肿瘤生长和转移的影响。方法 50只C57BL/6的LLC肺癌小鼠模型随机分成低(HA1)、中(HA2)、高(HA3)分子组,生理盐水组和无注射组,注射上述溶液,每3d一次,第25d处死。取肝、肺、脑、肾、肿瘤组织,计算脏体比;HE染色法观察病理学变化;免疫组化法观察胱天蛋白酶3、增殖细胞核抗原(PCNA)、透明质酸合酶2(HAS2)、透明质酸酶2在肿瘤中的表达。结果 HA3组远处器官转移率(55.6%)升高,分别向肝、肾、脑转移,尤以肝转移严重(88.9%)。肿瘤组织中,HA3组HAS2阳性表达减弱;HA2组PCNA阳性表达减弱,胱天蛋白酶3阳性表达升高。结论中分子HA抑制肿瘤生长;高分子HA促进肿瘤转移。

关键词：
免疫组化染色
动物实验
肺癌
肿瘤生长与转移
透明质酸
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透明质酸(HA)广泛分布于细胞间质中,是细胞外基质的重要成员之一。近年来的研究表明,肿瘤细胞周围富含HA,它们大多由肿瘤细胞表达产生。王玲研究显示[1],天然高分子量HA可抑制肿瘤细胞的生长,这可能与高分子量HA的理化性质有一定关系。此外,Ghatak等研究发现[2],外源性低分子量HA(分子量约2.5×106Da)在体外可抑制小鼠TA3/st乳腺癌细胞、大鼠C6神经胶质瘤细胞、人HCT克隆瘤细胞及人LX1肺癌细胞生长,抑制率在50%～100%。而HA含量的多少对肿瘤生长同样产生着影响。Bharadwaj等研究发现[3],HAS3所致过量HA可能诱导并改变前列腺恶性肿瘤细胞生长所需的平衡。

人体内HA是由透明质酸合酶(HAS)与透明质酸酶(HAases)共同作用所形成的[4]。HAS是HA在生物合成过程中的关键酶。HAS的功能失调能够导致HA合成下降,促进细胞和组织的生理过程向异常转化。研究表明,在大肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌的肿瘤生长、侵袭、转移过程中,HAS起到重要的作用[5]。HAases在肿瘤生长转移过程中也起了重要作用。HAases通过降解肿瘤细胞周围基质中的HA,帮助肿瘤细胞脱离原发肿瘤块;其次,癌细胞还利用HAases降解淋巴和血管基底膜,更容易进入血管内;此外,HAases通过分解转移灶附近的HA,为转移灶的肿瘤细胞迁移与转移提供空间。在所有的HAases分解HA过程中,都会不断产生HA片段。这些HA片段刺激了内皮细胞增殖和新生毛细血管生长,从而促进了肿瘤的扩散[6,7]。

本研究拟通过给C57BL/6肺癌小鼠注射低、中、高三种分子量大小HA溶液,观察不同分子量HA对肺癌小鼠体内肿瘤生长与转移的影响,以探究HA作为注射剂抑制或治疗部分肿瘤的可行性。

1、材料和方法

1.1材料

C57BL/6健康小鼠50只(SPF级),雄性,6～8周龄,体重(21.15±0.75)g,长春生物制品所实验动物室提供。小鼠Lewis肺癌细胞系(LLC)细胞,由吉林大学药学院生物化学研究室提供。不同分子量大小的透明质酸钠:0.2×106～0.4×106Da(低分子量)、1.3×106～1.5×106Da(中分子量)、1.8×106～2.2×106Da(高分子量)透明质酸钠,由华熙福瑞达生物医药有限公司提供。本实验所有切片图片均采用EUROStarⅢPlus显微镜行显微摄影。

1.2肺癌小鼠模型的建立

消化、收集小鼠LLC细胞,离心,去上清,无菌生理盐水洗涤2～3次,制成LLC细胞悬液。将此细胞悬液以0.2mL/只(细胞含量1×106/mL)分别注入50只健康雄性小鼠大腿右侧腹股沟皮下。注射后小鼠正常饲养21d,形成米粒大小的肿瘤,第22天开始为小鼠注射HA,注射HA溶液浓度1g/L[8,9]。

1.3肺癌小鼠皮下注射HA

将培养的肺癌小鼠模型50只,随机分成低(HA1)、中(HA2)、高(HA3)分子量HA组,生理盐水(NS)组和无注射(CK)组,每组10只。前3组分别在肺癌小鼠右侧腹股沟肿瘤团块的近心端皮下注射低、中、高分子量HA溶液,NS组也于腹股沟处注射生理盐水0.2mL,每3天注射1次,CK组不进行任何处理。每次给药后称量体重,观察注射局部有无异常状况。第25天处死所有动物,对小鼠的肝、肺、脑、肾以及肿瘤取材、称重。

1.4小鼠肿瘤生长和转移情况观察

将所取材料投入4%中性甲醛固定24h。固定后,常规石蜡包埋、切片。切片厚度5μm,备用。取上述切片行常规HE染色,并分别进行胱天蛋白酶(caspase)-3、增殖细胞核抗原(PCNA)、HAS2和HAases2免疫组织化学染色。显微镜观察所有肿瘤切片的免疫组化结果,并根据镜下观察的阳性情况将结果分为3级:零级(阴性)记0分、一级(阳性)记1分、二级(强阳性)记3分。以评分的高低显示一个组整体的阳性情况,阳性分数=(b+3c)/(a+b+c),公式中a、b、c分别代表一组中零级、一级、二级例数。

1.5统计学分析

采用SPSS19.0统计软件进行t检验和卡方检验。当数据例数足够多时用Pearson卡方分析,当数据例数少或出现个别例数为0时采用Fisher的精确检验。P<0.05具有统计学意义。

2、结果

2.1各分子量HA的刺激性观察

在小鼠右侧腹股沟皮下注射各分子量HA,48h后观察局部组织并未出现充血、水肿及硬结等异常变化。提示各分子量HA溶液浓度为1g/L时安全、无毒性。

2.2肺癌小鼠主要脏器重量和脏体比

与NS组相比,HA1组和HA3组的肝重量显著增高(P<0.05),HA3组的肺重量显著增高(P<0.05),HA3组肝的脏体比显著增高(P<0.05)。其他各组脏器重量和脏体比无显著差异(P>0.05)。

2.3肺癌小鼠肿瘤转移情况

采用下列评分法进行肺癌小鼠体内肿瘤转移分析:无转移(转移灶数量为0)、普通转移(转移灶数量小于2)和重度转移(转移灶数量大于2)。结果显示:NS组中9例普通转移,1例重度转移,转移率27.8%;HA1组中7例普通转移,3例重度转移,转移率27.8%;HA2组中11例普通转移,2例重度转移,转移率28.1%;HA3组中14例普通转移,6例重度转移,转移率55.6%。HA3组肿瘤转移显著高于NS组(P<0.05),HA1组与HA2组皆与NS组无显著差异(P>0.05)。

器官转移主要行肝转移,NS组5例普通转移,1例重度转移,重度转移率11.1%;HA1组肝脏5例普通转移,3例重度转移,重度转移率33.3%;HA2组7例普通转移,2例重度转移,重度转移率22.2%;HA3组2例普通转移,6例重度转移,重度转移率66.7%。HA3组肿瘤转移情况比NS组严重,两者相比有统计学意义(P<0.05)。且高分子量HA促进肝转移,而对肺和肾无显著影响(图1)。

图1各组肿瘤生长转移情况

2.4肺癌小鼠肿瘤生长状况

肺癌小鼠肿瘤组织的PCNA免疫组化(图2)评分统计结果显示:HA2组阳性程度显著低于NS组(P<0.05,图3)。HA1组和HA3组皆与NS组无显著差异(P>0.05)。

肺癌小鼠肿瘤组织的caspase-3免疫组化(图4)评分分析结果显示:各种分子量大小HA在一定程度上都可以促进部分肿瘤细胞的凋亡(图5)。

2.5肺癌小鼠肿瘤周围HAS2与HAases2分析

肺癌小鼠肿瘤组织的HAS2免疫组化评分结果显示:高分子量HA在一定程度上抑制了肿瘤周围HAS的合成(图6、7)。

肺癌小鼠肿瘤组织的HAases2免疫组化评分统计分析结果显示:各分子量大小HA对肿瘤周围HAases的合成并不产生太大影响(图8)

2.6HAS2染色阳性分数和肿瘤转移率对比

HA3组HAS2阳性分数最低、CK组和NS组最高,提示:高分子量组的HA合成最少,而转移率最高(见图9)。

图2各组肿瘤组织PCNA染色

图3各组肿瘤PCNA染色阳性程度

图4各组肿瘤组织caspase-3染色

图5各组肿瘤caspase-3染色阳性程度

图6各组肿瘤组织PCNA染色

图7各组肿瘤PCNA染色阳性程度

图8各组肿瘤组织caspase-3染色

图9各组HAS2染色阳性分数和肿瘤转移率对比

3、讨论

近年来研究表明,HA的含量和分子量大小对癌症的治疗有重要意义。Yamada等研究发现[10],HA的作用可能与其调节细胞的黏附、运动、生长和分化有关。Bharadwaj的研究结果提示:HAS3上调所致的过量HA可能诱导改变前列腺恶性肿瘤细胞生长所需的平衡。因此,HA分子量大小、肿瘤周围含量的多少,均影响肿瘤的生长与发展。

为探究HA治疗或抑制部分肿瘤的可行性,本研究采用了皮下注射不同大小分子量HA溶液的方法观察肺癌小鼠体内肿瘤在实验过程中的生长与转移情况。

肿瘤的生长是肿瘤细胞的增殖和凋亡综合的结果:当细胞增殖大于凋亡时,表现为肿瘤生长,反之,则抑制肿瘤生长。在肿瘤生长到一定程度时,会出现肿瘤的转移。

肿瘤细胞生长的分析显示:中分子量HA增殖小于凋亡,很好地抑制了肿瘤的生长;而高分子量HA增殖和凋亡相近,对肿瘤生长的抑制作用不明显。所以,从抑制肿瘤生长效果的角度来看,高分子量HA是不及中分子量HA的。

各分子量大小HA的注射,对于肿瘤细胞转移的影响也变得不同。肿瘤细胞转移的结果显示:皮下注射高分子量HA的小鼠,其体内发生了更多肿瘤细胞的转移。从单个器官来看,高分子量HA可能促进了肿瘤细胞向肝脏甚至其他脏器的转移,并且加重了各个脏器的肿瘤转移严重程度。故而外源性高分子量HA对肿瘤不存在治疗和抑制效果,甚至有可能促进了肿瘤的生长与转移。

HA的产生与肿瘤的转移也存在一定的联系。从对肿瘤细胞周围HAS2的分析显示:肿瘤的转移率的增高,与HAS2表达的减少是有着一定相关性的,但这种相关性的机制还并未确定。

综上所述,本实验通过对一系列HA溶液皮下注射的研究,发现了中分子量HA相比于其他两种分子量HA,有着良好的抑制肿瘤生长效果,同时也不会促进肿瘤细胞向其他脏器部位的转移。中分子量HA作为细胞外基质成分,具有无毒、安全性高、结构明确、易于生产和价格便宜等特点。因此本研究提示,中分子量HA可以作为一种新的肿瘤治疗研发方向。但同时,现阶段的研究也存在着局限性。本实验只将HA皮下注射到已有肿瘤的部位周围,而并未探究现实情况中大多数肿瘤生长部位的隐蔽与复杂状况,这为HA的注射与应用带来了挑战与困难。下一步工作将研究中分子量HA可否通过静脉注射,依靠血液抵达目标位置产生作用与效能。

参考文献：

[1]王玲.PEG-HA-MEL酯的合成及其给药系统的构建[D].武汉理工大学:武汉,2013.

[4]蒋延超,蒋世云,傅凤鸣,等.透明质酸生物合成途径及基因工程研究进展[J].中国生物工程杂志,2015,35(1):104-110.

[5]曲蕾,姬胜利.透明质酸及透明质酸酶与肿瘤的关系[J].中国生化药物杂志,2007,28(2):127-129.

[6]赖永勤,刘玉川,周正东,等.低分子量透明质酸功能与制备研究进展[J].食品与发酵科技,2015,51(6):78-80.

[9]符慧群,唐雪元,潘宇亮.川芎嗪和顺铂联用对小鼠Lewis肺癌生长和转移的抑制作用[J].南华大学学报(医学版),2008,36(1):46-49.

郝利铭,姜晶,赵广鑫,李永超,桑赫,韩雨桐.不同分子量透明质酸对肺癌小鼠体内肿瘤生长转移的影响[J].吉林医药学院学报,2020,41(03):161-165.