职业性矽肺(以下简称“矽肺”)是严重威胁公众健康的最为常见、进展最快、危害最严重的慢性职业病之一;其以广泛的肺结节性纤维化病变为主要病理表现,目前临床治疗效果不佳、预后较差[1,2]。在矽肺的发生发展中,游离二氧化硅(silica,SiO2)诱导核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族含热蛋白结构域蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain like receptorfamily pyrin domain-containing 3,NLRP3)炎性小体活化是关键事件[3]。NLRP3炎性小体激活后,将半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)前体剪切生成Caspase-1,后者将无活性白细胞介素(interleukin,IL)-1β前体(IL-1βprecursor,pro-IL-1β)剪切为成熟IL-1β(maturation IL-1β,mIL-1β),同时调控炎症因子IL-18的成熟与分泌;分泌的炎症因子启动肺部免疫炎症性反应,进而介导炎症和肺纤维化产生[4,5]。因此,早期干预AM的NLRP3炎性小体活化可能有利于延缓矽肺进程、改善患者预后。姜黄素是从郁金和姜黄等姜科植物中提取的一种多酚类中药单体,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种生物学效应[6,7]。有研究指出,姜黄素具有延缓肺纤维化形成的作用[8,9];但其作用机制尚不明确。本研究通过观察姜黄素对SiO2诱导的小鼠肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage,AM)的中NLRP3炎性小体活化的干预效果,初步探讨有关分子机制,旨在为临床应用姜黄素早期干预矽肺纤维化提供理论基础。

1、材料和方法

1.1动物

无特定病原体级健康C57BL/6小鼠[济南朋悦实验动物繁育有限公司,实验动物生产许可证号:SCXK(鲁) 20120001]5只,6周龄,体质量18～22 g。小鼠饲养在符合GB 14925—2010《实验动物 环境及设施》有关要求的屏障环境中,自由进食、饮水。本研究经山东中医药大学实验动物伦理委员会批准。

1.2仪器与试剂

MCO-15AC型电热二氧化碳培养箱(日本SANYO公司);ABI 7500型实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,q-PCR)仪(美国ABI公司);SpectraMax M2型酶标仪(美国Molecular Device公司);Nano Drop 2000型超微量分光光度计(美国Thermo Scientific公司);3.0 kD超滤管(美国GE公司); PowerPac Basic型电泳仪、MiniHD6型化学发光分析仪(美国Bio-Rad公司);硝酸纤维素膜(美国Pall公司)。磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)、opti-最低必需培养基(minimum essential medium,MEM)、RPIM-1640培养基(美国Gibco公司);红细胞裂解液、20×三乙醇胺缓冲盐(tris buffered saline,TBS)水溶液、吐温-20(上海碧云天生物技术有限公司);胎牛血清(以色列Biological Industries公司);100×青链霉素双抗混合液(北京索莱宝科技有限公司);游离SiO2粉尘(纯度99.0%,粒径1～5μm)、姜黄素(美国Sigma-Aldrich公司);氢氧化钠(国药集团化学试剂有限公司);核转录因子-κB(nuclear factor,NF-κB)通路阻断剂5-(4-氟苯基)-2-脲基噻吩-3-甲酰胺[(5-phenyl-2-ureido)thiophene-3-carboxamide,TPCA-1,美国Absin公司];Trizol试剂盒(北京天根生化科技有限公司);第一链cDNA合成试剂盒、实时荧光定量染料SYBR-Green(南京诺唯赞生物科技有限公司);小鼠组织细胞IL-1β酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(美国Marine Biological Laboratory公司);小鼠组织细胞IL-18 ELISA试剂盒(美国R&D Systems公司);10×RIPA细胞裂解液、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF,蛋白酶抑制剂)、电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)辣根过氧化物酶底物(加拿大Millipore公司);十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)试剂盒(上海雅酶生物科技有限公司);预染蛋白质相对分子质量标准(美国Thermo公司);Caspase-1剪切体(cleaved Caspase-1)、IL-1β、肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体、脱脂奶粉(美国Cell Signaling Technology公司);辣根过氧化物酶标记-羊抗鼠多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)。SiO2混悬液配制:SiO2研磨2 h后称质量,置15.0 mL离心管中高压蒸汽灭菌,烘箱过夜烘干,加入无菌PBS配制成质量浓度为5 g/L的SiO2混悬液。姜黄素储备液配制:姜黄素以质量体积比浓度为1.0%的无菌氢氧化钠溶液溶解后,以无菌PBS配制成浓度为1 mol/L储备液。PMSF终浓度为1 mmol/L RIPA细胞裂解液配制:以无菌去离子水将10×RIPA细胞裂解液稀释10倍后,每1.0 mL中加入10μL PMSF混匀;现用现配。

1.3方法

1.3.1 AM分离与培养

小鼠适应性饲养1周后,颈椎脱臼法处死,以静脉采血针进行气管插管。以1.0 mL注射器向气管插管内注入0.5 mL预冷PBS进行支气管肺泡灌洗,2 min后抽出灌洗液转移至无菌管中;反复10次,收集支气管肺泡灌洗约5 mL/只。以离心半径10 cm、800 r/min离心10 min后,加入红细胞裂解液裂解红细胞,以PBS洗涤2次,每次5 min;以含体积分数为10.0%胎牛血清的RPIM-1640培养基重悬细胞,调整细胞密度至5×108个/L铺板。于37℃、体积分数为5.0%的二氧化碳培养箱内培养4 h后,弃上清液,除去非贴壁细胞,加入含体积分数为10.0%胎牛血清的RPIM-1640培养基,获得贴壁培养的小鼠原代AM。

1.3.2细胞培养与分组处理

取AM以密度5×108个/L置于6孔板中,加入含体积分数为10.0%胎牛血清和剂量为1×105 U/L青链霉素双抗的RPIM-1640培养基,置于37℃、体积分数为5.0%的二氧化碳培养箱内培养24 h后,吸出培养液,每孔加入2.0 mL无血清opti-MEM。采用随机数表法分为6组;其中,对照组AM不予任何刺激;SiO2刺激组AM予终质量浓度为50 mg/L SiO2混悬液刺激(每孔加入质量浓度为5 g/L的游离SiO2混悬液20μL);NF-κB抑制组AM予终浓度为200 nmol/L的TPCA-1预处理1 h后,以终质量浓度为50 mg/L的SiO2混悬液处理;参照文献[10]并结合本研究预实验结果,姜黄素低、中、高剂量组AM分别予终浓度为20、40、50μmol/L的姜黄素预处理1 h后,以终质量浓度为50 mg/L的SiO2混悬液刺激。各组细胞均设3个复孔,于37℃、体积分数为5.0%二氧化碳培养箱中孵育6 h后,分别收获细胞和细胞培养液上清(经液氮速冻后保存于-80℃待测),进行后续实验。

1.3.3 q-PCR法检测AM内NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA表达

将1.3.2中收集的各组细胞按照Trizol试剂盒说明书操作步骤提取细胞总RNA,再按照第一链cDNA合成试剂盒说明书步骤采用两步法进行反转录反应,将总RNA逆转录为cDNA。以获得的cDNA为模板,与引物及荧光染料(2×SYBR Green)混合配制q-PCR扩增体系(20μL),q-PCR反应条件:95℃、3 min预变性;然后以95℃、15 s,60℃、30 s,72℃、15 s,进行40个循环;最后采用q-PCR仪默认程序进行熔解曲线测定。以对照组细胞结果为1.00,以2-△△Ct法分析目的基因相对表达水平。内参基因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,Gapdh)。引物由济南博尚生物技术有限公司合成(表1)。

表1目的基因引物序列

1.3.4 ELISA法检测AM的mIL-1β和IL-18分泌水平

将1.3.2中收集并保存在-80℃的细胞培养液上清,解冻后平衡至室温,采用IL-1β、IL-18 ELISA检测试剂盒按照说明书步骤稀释标准品和样品,其中标准品2倍比稀释共7个浓度以制作标准曲线,另设空白对照;于显色终止后,以酶标仪在450 nm波长下检测各样品的光密度,根据标准曲线计算细胞培养液上清中mIL-1β和IL-18水平,即为AM的mIL-1β和IL-18分泌水平。

1.3.5免疫印迹(Western blot)法检测AM中cleaved Caspase-1、pro-IL-1β和mIL-1β蛋白的表达与分泌水平

Western blot实验分为2部分。①将对照组、SiO2刺激组和姜黄素低、中、高剂量组5组细胞样品一起处理,进行Western blot实验,观察姜黄素干预剂量对有关指标的影响;②将对照组、SiO2刺激组、NF-κB抑制组和姜黄素中剂量组4组细胞样品一起进行Western blot实验,比较NF-κB抑制剂与姜黄素干预对有关指标的影响。实验步骤如下:对经1.3.2处理的各组细胞,首先收集各组细胞的培养液上清,采用超滤管以离心半径10 cm、14 000 r/min离心45 min进行超滤,收集超滤后样品检测,有关结果反映细胞分泌cleaved Caspase-1和mIL-1β蛋白的水平。随后将细胞用预冷PBS洗涤2次,收集细胞;每孔细胞以200μL PMSF终浓度为1 mmol/L的RIPA细胞裂解液重悬,漩涡混匀后置于冰上裂解15 min;4℃、离心半径10 cm、14 000 r/min离心15 min,收集细胞裂解液上清检测,有关结果反映细胞内cleaved Caspase-1、pro-IL-1β和mIL-1β蛋白相对表达水平。各组细胞培养液上清超滤后的样品和细胞裂解液上清均以超微量分光光度计测定蛋白质量浓度,调整各样品蛋白质量浓度至1 g/L。取各样品蛋白100μL,按照4∶1(V/V)加入5×SDS上样缓冲液,99℃加热10 min使蛋白彻底变性。常规进行SDS-PAGE电泳,浓缩胶、分离胶体积分数分别为5.0%和12.5%,上样量为15μL;浓缩恒压80 V、20 min,分离恒压120 V、90 min。电泳完毕后,恒流300 mA湿式转膜60 min,将蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上。用质量分数为5.0%的脱脂牛奶室温封闭2 h。分别加入一抗Caspase-1、IL-1β和β-actin单克隆抗体(稀释比例均为1∶1 000),4℃孵育过夜,用含体积分数为0.1%吐温20的TBS(TBS with Tween-20,TBST)洗涤3次,每次5 min。加入二抗辣根过氧化物酶标记-羊抗鼠多克隆抗体(稀释比例为1∶10 000)室温孵育1 h,以TBST洗涤3次,每次5 min。ECL法显色后,立即以化学发光分析仪成像,以Image J软件定量分析灰度,以β-actin为内参,计算cleaved Caspase-1、pro-IL-1β和(或)mIL-1β蛋白的相对表达水平或分泌水平。pro-IL-1β蛋白是IL-1β基因编码的完整蛋白,相对分子质量约31.0 kD;NLRP3炎性小体活化后,pro-IL-1β蛋白被cleaved Caspase-1蛋白剪切为相对分子质量为17.5 kD的mIL-1β,因此可以观察到pro-IL-1β和(或)mIL-1β的蛋白条带。

1.4统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料经正态性检验服从正态分布者以x¯±s描述;多组组间均数比较采用单因素方差分析,组间均数两两比较如方差齐则采用LSD检验,如方差不齐则采用DunnettT3检验。计量资料经正态性检验不符合正态分布者以中位数和四分位数间距[M(Q)]描述,多组组间M比较采用完全随机设计Kruskal-Wallis H检验。以SiO2刺激组和姜黄素低、中、高剂量组4组AM有关指标(yˆ)与姜黄素干预剂量(x)的剂量-效应关系分析采用一元线性回归分析。检验水准α=0.05(双侧)。

2、结 果

2.1各组AM中NLRP3炎性小体相关基因mRNA相对表达水平

6组AM中NLRP3炎性小体相关基因NLRP3、Caspase-1、IL-1β的mRNA相对表达水平和mIL-1β、IL-18的分泌水平分别比较,差异均有统计学意义(P<0.01);两两比较结果见表2。一元线性回归分析结果显示,AM中上述指标均呈现随着姜黄素干预剂量的增加而下降的剂量-效应关系,差异均有统计学意义(P<0.01)。见表2。

2.2姜黄素干预剂量对AM中cleaved Caspase-1、pro-IL-1β和(或)mIL-1β蛋白表达与分泌的影响

如图1所示,对照组细胞裂解液与培养液上清中cleaved Caspase-1、mIL-1β蛋白条带均基本观察不到;SiO2刺激组、姜黄素低剂量组、姜黄素中剂量组细胞裂解液与培养液上清中均可检测到cleaved Caspase-1和mIL-1β蛋白;姜黄素各剂量组细胞的cleaved Caspase-1和mIL-1β蛋白相对表达水平均随姜黄素处理剂量增加而逐渐减少,以姜黄素高剂量组抑制作用最为明显;而各组细胞裂解液中均可观察到较明显的pro-IL-1β蛋白条带。各组AM中cleaved Caspase-1、pro-IL-1β、mIL-1β蛋白相对表达水平与cleaved Caspase-1、mIL-1β蛋白分泌水平分别比较,差异均有统计学意义(P<0.01);两两比较结果见表3。一元线性回归分析结果显示,AM中上述指标均呈现随着姜黄素干预剂量的增加而下降的剂量-效应关系,差异均有统计学意义(P<0.01)。见表3。

2.3NF-κB抑制剂与姜黄素干预对AM中cleaved Caspase-1、pro-IL-1β和(或)mIL-1β蛋白表达与分泌影响的比较

各组AM中cleaved Caspase-1、pro-IL-1β、mIL-1β蛋白的相对表达水平与cleaved Caspase-1、mIL-1β蛋白分泌水平分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05);两两比较结果见图2、表4。

表2各组AM中NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA相对表达水平和mIL-1β、IL-18分泌水平比较

表3 5组AM中cleaved Caspase-1、pro-IL-1β、mIL-1β蛋白的相对表达与分泌水平比较

图1不同剂量姜黄素对AM中cleaved Caspase-1、pro-IL-1β和mIL-1β表达和分泌的影响

图2 NF-κB抑制剂和姜黄素干预对AM中cleaved Caspase-1、pro-IL-1β和mIL-1β蛋白表达及分泌的影响

表4姜黄素干预和NF-κB抑制剂对AM中cleaved Caspase-1、pro-IL-1β、mIL-1β蛋白表达与分泌水平的影响

3、讨 论

矽肺的发生发展与早期炎症介质释放、氧化应激、细胞外基质合成与降解相关酶的异常等密切相关;其中炎症介质的致纤维化作用日益受到重视[11,12,13]。NLRP3是促进小鼠矽肺模型中早期炎症发生的重要危险受体,并且NLRP3-IL-1β通路在游离SiO2所致的肺纤维化中发挥关键作用[3,14]。SiO2是一种可有效激活NLRP3炎症小体的外源性危险信号;其激活机制可能是SiO2被蛋白受体(如Toll样受体)识别后,产生可被NLRP3识别的胞内信号(三磷酸腺苷、活性氧等),间接激活NLRP3炎症小体[15]。AM是游离SiO2作用的主要靶细胞[16]。游离SiO2粉尘进入机体后,首先攻击AM,导致细胞凋亡;而AM吞噬SiO2后,胞内的粉尘溶解可形成聚合硅酸,溶酶体膜与硅酸的活性羟基反应后可造成溶酶体膜通透性增加甚至破裂,进一步激活NLRP3炎症小体[17,18]。NLRP3炎症小体是由NLRP3蛋白、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)和Caspase-1组成的高分子蛋白复合体[19];其通过NLRP3/ASC/Caspase-1轴调控IL-1β和IL-18等促炎性因子的成熟和分泌;当其过度激活时可导致细胞炎性凋亡、组织损伤及加剧炎症性疾病的发展[20]。NF-κB是炎症的重要催化剂,其被微生物组件如Toll样受体配体或内源性分子激活后,可迅速启动NLRP3蛋白表达[21,22]。因此,有活性的NF-κB也可视作NLRP3的一种胞内活化信号。天然单体药物姜黄素药理活性广泛,对百草枯、博来霉素、胺碘酮和辐射等环境因素所导致的肺纤维化动物模型具有良好的干预效果,具有抗炎、抑制细胞外基质过度沉积、减轻气道重塑和延缓肺纤维化形成等作用[23,24,25,26]。有文献报道,姜黄素可通过调节促炎细胞因子和相关信号通路,如抑制NF-κB介导的炎症,从而有效地对抗炎症[27,28]。姜黄素可抑制NLRP3炎性小体的激活,这是其应用于疾病治疗的重要机制之一[29,30]。因此,本研究着重探讨姜黄素抑制SiO2诱导AM的NLRP3炎性小体活化情况和相关机制。

本课题组前期研究结果显示,NLRP3-Caspase-1-IL-1β/IL-18信号通路与在矽肺肺纤维化的发生发展中起到重要作用;游离SiO2可刺激AM,诱导NLRP3蛋白表达,与ASC和Caspase-1相互结形成炎症小体,通过调控多种促炎细胞因子如IL-1β和IL-18的成熟与分泌,引起肺部炎症反应,最终导致肺部纤维化[13]。本研究结果显示,与对照组比较,SiO2刺激组AM中NLRP3炎性小体相关基因NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA相对表达水平和mIL-1β、IL-18分泌水平均升高(P<0.05),cleaved Caspase-1、pro-IL-1β和(或)mIL-1β蛋白相对表达水平与分泌水平均升高(P<0.05)。推测游离SiO2刺激AM后,可通过激活NLRP3- Caspase-1-IL-1β/IL-18信号通路,导致AM产生炎性反应。有研究指出,游离SiO2颗粒进入AM后,并非直接作用刺激AM激活NLRP3炎性小体,而是通过激活NF-κB介导的信号通路诱导NLRP3炎性小体的活化[31,32]。本研究中,NF-κB抑制组AM中NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA相对表达水平和mIL-1β、IL-18分泌水平均低于SiO2刺激组(P<0.05);提示当予NF-κB抑制剂预处理AM后,可抑制NLRP3-Caspase-1-IL-1β/IL-18信号通路,减少NLRP3炎症小体的形成,并抑制Caspase-1激活,最终减少活化IL-1β和IL-18的生成与分泌,减少继而减轻炎性反应的发生发展。

较多研究结果显示,姜黄素可通过抑制NF-κB信号通路而发挥抗炎活性[33,34]。本研究结果显示,除姜黄素低剂量组cleaved Caspase-1和mIL-1β蛋白相对表达水平外,3个姜黄素剂量组AM中NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA相对表达水平,mIL-1β、IL-18分泌水平,以及cleaved Caspase-1、pro-IL-1β和(或)mIL-1β蛋白相对表达水平与分泌水平均低于SiO2刺激组(P<0.05),上述指标均呈现随姜黄素干预剂量的增加而下降的剂量依赖性关系(P<0.05);特别是姜黄素高剂量组AM上述指标分别与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。考虑到本研究采用游离SiO2刺激AM的时间为6 h,属于细胞毒作用早期阶段;上述结果提示姜黄素早期干预可减轻SiO2刺激AM的早期炎性反应,其作用机制可能与调节NLRP3-Caspase-1-IL-1β/IL-18信号通路有关。

本研究的进一步分析结果显示,姜黄素中剂量组和NF-κB抑制组AM中3个NLRP3炎性小体相关基因的mRNA相对表达水平均低于SiO2刺激组(P<0.05);提示姜黄素可能具有与NF-κB通路阻断剂TPCA-1相似的抑制NF-κB通路的作用。本研究还观察到,姜黄素中剂量组和NF-κB抑制组mIL-1β、IL-18分泌水平,以及mIL-1β蛋白相对表达水平与分泌水平均低于SiO2刺激组(P<0.05),但以姜黄素中剂量组的下降更甚;提示姜黄素可能通过直接阻断NLRP3炎症小体活化的某一关键事件而发挥抗炎作用。推测姜黄素可能一方面抑制SiO2刺激AM的NF-κB信号通路活化,从转录水平下调NLRP3炎性小体相关基因的表达;另一方面直接阻断NLRP3炎性小体的活化、组装及下游分子剪切,以上2种机制介导了姜黄素抑制SiO2诱导AM的NLRP3炎性小体活化的药理作用。

综上所述,姜黄素可通过抑制游离SiO2诱导AM的NLRP3炎性小体活化,从而发挥抗炎和抗纤维化的作用。该过程可能与姜黄素抑制NF-κB信号通路和直接阻断NLRP3炎性小体活化有关;且本研究有关数据提示可能后者作用更为直接高效。本研究结果为姜黄素应用于矽肺治疗提供了理论基础。但矽肺所致的肺纤维化形成机制复杂、体内影响因素众多,姜黄素应用于临床仍需进行更为深入的实验研究。

参考文献：

[8]施婵妹,黄琨伦,闵婧琦,等.姜黄素对肺部疾病的作用研究进展[J].医学研究杂志,2019,48(2):15-17,74.

[9]范沐霞,赵塔娜,王丽敏,等.姜黄素抗纤维化研究进展[J].中医学报,2019,34(11):2343-2348.

[14]宋占帅,邵华,陈艳芹,等.NLRP3在矽肺肺纤维化发生发展中的作用及MCC950应用研究[J].中国职业医学,2018,45(6):691-696.

[16]张舒宁,乔燕,胡志乔,等.熊果酸对矽肺大鼠肺泡巨噬细胞数量和波形蛋白表达的影响[J].中国职业医学,2018,45(5):572-576,580.

[17]杨萌,王娜,姚三巧.多聚鸟嘌呤核苷酸对矽尘致大鼠肺纤维化干预作用及机制研究[J].中国职业医学,2017,44(1):25-30.

[19]潘徐彪,李向玉,王志鑫,等.NLRP3-(Caspase-1)/IL-1β信号通路的研究进展[J].中国医药导报,2019,16(1):41-44.

[20]蔡治祥,王晓武,李莉,等.NOD样受体蛋白3炎性小体与肺部疾病的研究进展[J].实用医学杂志,2019,35(22):3553-3557.

[31]丁杨,胡容.NLRP3炎症小体激活及调节机制的研究进展[J].药学进展,2018,42(4):294-302.

[32]贺今,刘光峰,李建业,等.NLRP3炎症小体在尘肺病肺纤维化中作用[J].中国职业医学,2019,46(1):126-128,132.

[33]张金兰,李朝霞,黄支隆.姜黄素在肺部疾病中的研究进展[J].贵州医药,2019,43(1):42-45.

宋楠楠,杜忠君,贾强,陈尚雅,朱文文,杨旭,侯珊珊,邵华.姜黄素抑制游离二氧化硅诱导小鼠肺泡巨噬细胞NLRP3炎性小体活化机制[J].中国职业医学,2020,47(02):121-128.

基金:国家自然科学基金(81872575);山东省自然科学基金(ZR2018MH036,ZR2017MH020);山东省重点研发计划(2019GSF107055)