中东呼吸综合征（MERS）是由中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）引起的一种传染性和高致死性的呼吸系统疾病，主要表现为非典型性肺炎和急性呼吸综合征，严重者可引发肾衰竭而死亡。MERS-COV于2012年首次被发现，是一种新型的β属冠状病毒，是继严重急性呼吸道综合征冠状病毒（SRAS-COV）出现之后，又一种对人类具有致死性的冠状病毒。截止2019年11月底，MERS已经蔓延至27个国家，2494例实验室确诊病例，其中858例死亡，病死率高达34.4%[1]。MERS感染病例大部分位于中东地区，包括2102例实验室确诊病例（病死率达37.1%），其它地区的感染也多与中东地区有关。2015年韩国爆发MERS-CoV疫情，导致186起病例，其中36例死亡[2]。尽管MERS-CoV与蝙蝠冠状病毒HKU4和HKU5具有密切的基因组相似性[3]，但血清学和分子流行病学证据表明，单峰骆驼是MERS-CoV最主要的中间宿主，也是人类MERS的动物传染源[4]。医院内感染是大多数病例的主要传播途径，老年人、免疫系统较弱的人以及患有肾病、癌症、慢性肺病和糖尿病等慢性病的人为易感人群。韩国的疫情引起人们对MERS-CoV扩散至中东以外地区的担忧，提高了对预防和治疗MERS的重视。阻断骆驼传播及院内感染是控制疫情的最好方法，开发安全有效的疫苗在MERS-CoV疫情防控中有重要的公共卫生学意义。

1、MERS-CoV病原学

MERS-CoV的基因组是单链正义RNA，其长度为30.1kb(30119nt），包含10个开放阅读框（ORF），编码16种非结构蛋白（nsp1-16）和四种结构蛋白：棘突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、基质蛋白（M）和核衣壳蛋白（N)[5]。四种结构蛋白组成球形、似王冠样病毒颗粒，其中S和N具有很强的免疫原性，都可以诱导T细胞应答。S蛋白为三聚体状态的I型跨膜糖蛋白，位于病毒膜表面，介导病毒附着宿主细胞及病毒-细胞膜的融合，是细胞靶向性和发病机制的主要决定因子。S蛋白包含S1亚基和S2亚基两个功能子单元，S1亚基包含N端结构域（NTD）和独立折叠的受体结合域（RBD），与细胞受体二肽激肽酶4(DPP4）结合，介导病毒颗粒附着于细胞[6];S2亚基包含N端疏水融合肽（FP）以及两个七肽重复序列HR1和HR2，促进病毒与宿主细胞膜的融合[7]。S蛋白能够诱导机体产生中和抗体（NAbs），该NAbs在预防MERS-CoV感染中发挥关键作用[7,8,9]。研究发现，全长S蛋白、S1以及RBD均可作为开发MERS-CoV疫苗和治疗抗体的靶点。而S2，尤其是其HR1区域，是开发融合抑制剂的理想靶点[10]。以S蛋白为靶点的单克隆抗体、纳米抗体对转基因小鼠、兔子和非人类灵长类动物（NHPs）的MERS-CoV感染具有明显的保护作用[10,11,12]。

2、MERS疫苗研究进展

自2012年出现疫情以来，MERS-CoV疫苗研究取得了一些进展，包括：DNA疫苗、蛋白质亚单位疫苗、病毒载体疫苗、灭活疫苗和减毒活疫苗等。到目前为止，人源多克隆抗体（SAB-301）在临床试验阶段，GLS-5300和MERS001两个疫苗候选者处于临床试验I期，其余候选疫苗处于临床前试验阶段[13]。

2.1动物模型

因为物种间的DPP4受体序列存在差异，MERS-CoV不能在仓鼠、雪貂和小鼠等小动物模型中复制，因此建立准确、可复制和可预测的动物模型评估候选疫苗的有效性，是疫苗研究的关键和挑战。研究表明MERS-CoV对单峰骆驼、美洲驼、猪和兔子敏感，但对山羊、绵羊和马不敏感[14,15]。MERS-CoV能感染恒河猴和狨猴等NHPs[16,17]，引起肺部不同程度的组织病理学变化及肺炎。因此，NHPs可以作为一种评估保护性免疫的有效动物模型，但其高成本限制了它的应用。MERS-CoV主要感染单峰骆驼的鼻粘膜，且只有轻微的症状，体型庞大以及特殊的生存环境限制了它们的实际应用。Adney等[15]报道了MERS-CoV感染羊驼科的动物模型，可以在动物研究中替代骆驼。兔子作为MERS-CoV感染模型，通过鼻腔和气管途径注射MERS-CoV，观察不到临床症状和肉眼可见的病变，但在显微镜下能观察到鼻腔和肺部的组织病例学变化[18]。近年来报道了多种表达MERS-CoV受体hD-PP4的小鼠模型，包括Ad5/hDPP4转导小鼠、hDPP4-Tg小鼠及HuDPP4小鼠等[19,20,21]。与大型动物模型相比，小鼠模型可作为评价MERS疫苗疗效的简便、经济的载体。Ad5/hDPP4转导小鼠感染后表现出短暂的化脓性疾病和肺部病变，并且疾病的发展依赖于转导效率，hDPP4仅短暂的在肺部表达，由于缺乏呼吸临床症状，该模型不能用于临床呼吸道疾病的分析[19]。hDPP4-Tg小鼠的MERS-CoV感染伴有呼吸系统表现和病毒血症，是目前唯一有严重临床变现或死亡的小鼠模型。但hDPP4在Tg小鼠体内的广泛表达会导致神经系统病变和呼吸道病变，这和人类感染MERS-CoV的临床特点有所不同[20]。HuDPP4小鼠能保留了正常DPP4的表达模式，经鼻内感染MERS-CoV后，HuDPP4小鼠无症状，但出现与支气管间质性肺炎相一致的肺部病变，可在肺部检测到高水平的MERS-CoVRNA和传染性病毒[21]。HuDPP4小鼠可用于轻度MERS-CoV感染模型，HuDPP4小鼠和hDPP4-Tg小鼠模型都可以用于抗病毒药物和疫苗的筛选，每种模型都有其自身的优势。

2.2DNA疫苗

DNA疫苗是指目的基因片段插入含有表达调控元件的DNA质粒中，将其直接递送体内，使外源基因在活体内表达，表达的抗原诱导机体产生特异的细胞免疫和体液免疫应答。DNA疫苗具有独特的优势，如完整的抗原蛋白折叠、快速的设计和生产、成本低廉和热稳定性，便于储存和运输等。然而，相比其它类型的疫苗，DNA疫苗往往引起较低的免疫反应[22]。DNA疫苗研究中最常报告的不良事件是注射部位的局部疼痛和非特异性全身症状，如不适和发热。基于S1亚基的DNA疫苗在Ad5/hDPP4小鼠中测试了其保护效力，结果表明该疫苗能诱导产生特异性的体液和细胞免疫反应，DNA疫苗或DNA疫苗免疫小鼠的血清被动免疫均可保护Ad5/hDPP4小鼠免受MERS-CoV的感染[23,24]。由InovioPharmaceuticals和GeneOneLifeScience公司开发的表达S蛋白全长的DNA疫苗（GLS-5300）能降低恒河猴肺部的MERS-CoV病毒载量，且未表现出任何肺炎的临床或影像学症状[25]，该疫苗在小鼠、猕猴和骆驼都能诱导特异性NAbs和强烈的细胞免疫，目前该DNA疫苗已进入I期临床试验[26]。使用DNA疫苗初免，亚单位蛋白疫苗加强免疫的方案能提高免疫原性，降低逃逸突变的可能性。与单独的亚单位蛋白疫苗免疫相比，SDNA疫苗初免-S1蛋白增强免疫能产生功能多样的NAbs，也产生Th1免疫反应。Chi等[24]研究表明，全长SDNA疫苗与配伍alum佐剂的S1蛋白疫苗的组合在HuDPP4小鼠和NHPs中都能诱导产生MERS-CoVNAbs。全长SDNA疫苗比截短、缺失跨膜区的S或S1的DNA疫苗能诱导小鼠产生更高的体液应答。在NHPs中，SDNA-S1蛋白或S1DNA-S1蛋白联合免疫能显著减轻肺浸润和肺部病变中和抗体。在小鼠和NHPs中，S1蛋白或SDNA初免随后S1蛋白加强免疫，比SDNA单独免疫能引发更高的抗体滴度。

2.3蛋白质亚单位疫苗

蛋白质亚单位疫苗是利用生物表达系统高效表达免疫原，一般安全性和耐受性良好。为了提高亚单位疫苗的免疫原性，有必要使用适当的佐剂、佐剂组合或免疫增强剂（如人类IgGFc），并且优化免疫途径和注射剂量。SARS-CoV的研究已经确定S1亚基（尤其是RBD）可作为NAbs在小鼠、NHPs和人类中的主要靶点[27,28,29]。同样，RBD作为MERS-CoVS1亚单位内的一个短片段，也被应用于VLP和亚单位疫苗的研发，在小鼠、兔和NHPs模型中进行了免疫原性和有效性的测试。MERS-CoVRBD的亚单位疫苗，除了对小鼠和兔子具有较高的免疫原性和较强的保护作用外，对NHPs也具有免疫原性和保护作用。RBD亚单位蛋白免疫NHPs，可以诱导出强而持久的免疫反应和NAbs，并对MERS-CoV攻击具有保护作用[30,31,32]。特别是，在佐剂（如MF59）或免疫增强剂（如Fc标记）融合的情况下，MERS-CoVRBD诱导的免疫反应和NAbs显著增强。Zhang等[33]研究表明，MERS-CoVS蛋白RBD中377-588位残基能够引起强烈的体液和细胞反应，并可通过添加佐剂MF59来增强。Nyon等[34]利用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系表达融合人IgGFc片段的RBD377-588残基，与AddaVax佐剂联合免疫hDPP4Tg小鼠，可以抵抗MERS-CoV攻击。RBD经聚糖探针掩蔽非中和表位后免疫小鼠，能增强NAbs反应，在MERS-CoV攻击时，表现出更高的存活率和更少的体重减轻，表明在疫苗设计中消除阴性表位，暴露阳性表位能显著增强亚单位疫苗的效力[35]。MERS-CoVRBD亚单位疫苗能引起广谱NAbs，能对不同来源的MERS-CoV毒株（包括来源于人、骆驼和抗体逃逸突变株）产生交叉免疫保护[30]。除了亚基RBD,S蛋白的重组N端结构域（rNTD），配伍佐剂alum或CpG时，诱导Ad5-hDPP4小鼠产生体液（IgG和NAbs）和T细胞免疫应答。Coleman等[36]证明重组的MERS-CoVS纳米颗粒与基质M1佐剂诱导的NAbs，有效地阻断MERS-CoV的复制，降低肺部病毒滴度和病毒mRNA水平，表明MERS-CoV的蛋白质纳米颗粒也是一种具有潜力的候选疫苗。

2.4病毒载体疫苗

病毒载体的MERS-CoV疫苗被广泛研究，比如牛痘病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒、狂犬病病毒和麻疹病毒等载体。表达S或S1抗原的重组病毒在小鼠或NHPs模型中均表现出较强的免疫原性，其中一些在MERS-CoV攻毒小鼠模型中表现出保护作用。然而，载体的原有免疫力可能会影响抗原特异性免疫反应的诱导，可能会引起超炎症反应[37,38]。迄今为止表达不同长度S蛋白的基于病毒载体的MERS-CoV疫苗正在开发中。改良牛痘病毒安卡拉（MVA）和腺病毒载体已被用于表达MERS-CoVS蛋白。德国感染研究中心研制了一种基于MVA的S蛋白全长型候选疫苗（MVA-S），在hDPP4转导小鼠中进行评估，产生了强烈的NAbs反应，下呼吸道内病毒复制减少[39]。接种过MVA-S的骆驼，与对照动物相比，上呼吸道的临床症状（鼻炎）和感染性病毒滴度都显著降低，接种过疫苗的骆驼鼻腔中只存在较低水平的感染性MERS-Cov颗粒，几乎没有病毒RNA，已进行MVA-MERS-S的I期临床试验。黑猩猩腺病毒（ChAd）载体被广泛应用[32]，包括艾滋病、疟疾、埃博拉、SARS、丙型肝炎、狂犬病和癌症等的研究。Jia等[40]构建了一个重组罕见血清型AdC68表达S蛋白全长（AdC68-S），鼻内单次免疫AdC68-S可诱导BALB/c小鼠产生强烈而持久的NAbs和T细胞反应，能完全保护HuDPP4小鼠免受MERS-CoV致死性攻击。Jenner研究所研制的以缺陷型ChAd(ChAdOx1）为载体表达S蛋白全长的疫苗MERS001，已进入I期临床试验阶段[41]。Alharbi等[8]对MERS001和MVA-S候选疫苗的体液和细胞免疫反应进行了研究。在BALB/c小鼠中，MERS001和MVA-S能诱导产生NAbs和细胞免疫反应；单剂量的MERS001疫苗添加人组织纤溶酶原激活剂（tPA）与双剂量MVA疫苗添加tPA诱导的体液免疫反应等效。Hashem等[42]研制了以人5型腺病毒为载体的MERS-CoVS1疫苗，并辅以CD40L作为靶向分子和分子佐剂，证明有良好的免疫原性和有效性。表达全长或截断S的麻疹病毒（MV）载体疫苗，诱导小鼠产生强烈的MV和MERS-CoV特异性的NAbs，并在IFNAR？/？小鼠体内引起特异性T细胞的反应[43]，也在小鼠模型中证明其对MERS-CoV攻击具有保护作用。Liu等[44]用MERS-CoVS替换VSVG构建VSV病毒载体疫苗（VSVΔG-MERS），在恒河猴体内诱导产生NAbs反应和T细胞反应。

2.5其他疫苗

减毒活疫苗和灭活疫苗作为传统疫苗也被用于研究预防MERS-CoV。减毒活疫苗可引发机体免疫反应，刺激机体产生特异性的记忆B和T细胞，获得长期或终生保护的作用。与灭活疫苗比较，减毒活疫苗具有免疫力强、作用时间长的优点。与非复制疫苗相比，活性减毒活疫苗以自然感染的方式向免疫系统呈现抗原，能诱导更强的免疫反应，抵御病毒挑战。利用反向遗传系统，通过删除致病基因构建减毒活疫苗，但潜在的毒性反应可能会引起免疫系统的反应，对一些个体（如免疫缺陷者）可能诱发严重疾病。Almazan等[45]构建了缺失E蛋白的MERS-CoV病毒株rMERS-CoV-E，该病毒不具有复制能力，但可以在表达E蛋白的细胞中被拯救，缺失E基因的病毒可以作为安全疫苗候选的基础。在MERS-CoV病毒感染时，免疫MERS-CoV灭活疫苗的动物存在着肺部病理变化的风险，有效和安全的疫苗需要适当的佐剂甚至佐剂组合。Deng等[46]研制了以0.4%甲醛灭活的MERS-CoV疫苗（IV），并应用alum+CpG佐剂，引发机体产生S蛋白特异性IgG抗体。IV免疫的Ad5-hDPP4小鼠，MERS-CoV攻击后，肺内病理损伤比较轻微，且肺内几乎没有检测到病毒，可以进一步在骆驼或者临床试验中进行安全验证。

3、讨论

近年来MERS-CoV的研究发展迅速，已经有多项MERS-CoV的专利申请，包括人源的MERS-CoVRBD的核酸序列、抗MERS-CoVS蛋白单克隆抗体以及RBD-Fc融合蛋白导等。MERS-CoV抗体研究取得很大进步。Stalin等[47]报道的骆驼/人嵌合的重链抗体（HcAbs）在血清中有较长的半衰期，并保护小鼠免受致命MERS-CoV的攻击。Zhao等[12]在高产酵母中表达的新型纳米抗体与MERS-CoVRBD具有高亲和力，能够阻断MERS-CoVRBD与受体的结合，完全保护HuDPP4小鼠免受致命的MERS-CoV攻击。迄今为止，已有20多种中和抗体被研究[48,49]，大多是靶向RBD中和表位，有6种是靶向NTD中和表位，在体内或体外实验中证明了其对MERS-CoV的中和作用，为抗体药物与疫苗研发、防止MERS-CoV感染提供了理论依据和思路。DNA疫苗和病毒载体疫苗的研究已经取得了很大进展，迄今为止有三个疫苗候选者GLS-5300、MVA-MERA-S和MERS001，进入临床试验I期。其他类型的疫苗如改良的mRNA疫苗，应用前景较好[50,51]。MERS-CoV亚单位疫苗可能集中在优化免疫途径、注射剂量以及相关佐剂的合理使用。另外，须对检测试剂和检测方法进行标准化，包括以病毒或假病毒为基础的中和抗体实验。据报道，在缺乏佐剂的情况下，SARS-CoV疫苗诱导的Th1反应不足导致嗜酸性细胞免疫病理反应，这种担忧在MERS-CoV疫苗中同样存在。目前已经研究了多种佐剂，如alum、MF59、Matrix-M1、CpG和Poly(I:C)[52,53,54]，证明可以增加NAbs滴度和改善肺嗜酸性免疫病理，表明佐剂可用于MERS-CoV疫苗研究，以提高免疫原性和安全性。包括MERS-CoV在内的高致病性冠状病毒的出现引起了人们的关注，制定全球疾病预防和控制战略有刻不容缓。充分利用基因工程技术，研制安全、高效的MERS-CoV疫苗或其他新型病毒免疫制剂对预防、控制MERS-CoV疫情蔓延具有重要实际意义。

燕丽娜,赵忠欣,孙培录,许彤,郑学星,郑文文.中东呼吸综合征疫苗研究进展[J].中国病原生物学杂志,2020,15(03):359-363.

基金:山东省自然科学基金项目(No.ZR2019QC010,ZR2016CQ18);中国博士后科学基金项目(No.2015M580592,2016T90637);中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(No.2018JC050).