慢性阻塞性肺疾病(COPD)是呼吸系统疾病中的常见病和多发病，患病率和病死率均居高不下。调查显示，我国40岁及以上人群COPD患病率高达13.7%[1]，其病因可能是多种环境因素与机体自身生长因素长期相互作用的结果。吸入刺激物(如香烟等)可引起过度的炎症反应，逐渐导致气流受限。目前广泛认为气道、肺实质及肺血管的慢性炎症是COPD的特征性改变[2,3]。炎症反应使得巨噬细胞、中性粒细胞和T细胞显著升高，进而引发氧化应激反应，而氧化应激又可激活前炎基因的表达，引发一系列的肺部炎症反应，从而导致气道上皮损伤，气流受限，蛋白酶/抗蛋白酶失衡等，使得COPD进程加速[4,5]。在炎症反应中，肿瘤坏死因子-(TNF-)是首先产生的一种广泛的前炎症细胞因子，在COPD的急性发作中常伴有TNF-的急剧增高，其后果是促进炎症细胞趋化和活化，破坏气道结构[6,7]。角蛋白趋化因子(kKC)和巨噬细胞炎症蛋白2(MIP-2)是CXC类趋化因子中的重要成员，这些趋化因子的表达水平反映了机体炎症情况[8,9]。

红豆杉，也称紫杉，是一种常绿针叶乔木或灌木，散生于林中，是经过了第四纪冰川遗留下来的古老树种，在地球上已有250万年的历史，是世界上公认的濒临灭绝的天然珍稀抗肿瘤植物[10]，红豆杉属植物具有突出的广谱抗肿瘤活性，其中主要的活性成分是紫杉醇[11]。近年来，随着研究的深入，发现红豆杉属植物还具有抗老年痴呆、降血糖、免疫调节、减轻缺血再灌注导致的心肌损伤、保肝等多方面的药理作用[12,13,14,15]。然而红豆杉具有一定的毒性，在很大程度上限制了其临床应用。本研究通过对红豆杉的叶、干、根、皮按一定比例在55～65白酒进行浸渍减毒处理[16]，获得了红豆杉无毒提取物，并首次采用经典的烟熏小鼠模型[17]，对该提取物进行COPD动物药效学评价研究。

1、材料

1.1材料

清洁级C57BL/6小鼠60只，♀♂各半，♀体质量为(20±2)g，♂体质量为(25±2)g,4～8周龄，购买于南京生物医药研究院，实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2015-0001；质量合格证：201705990。所有操作和实验流程均遵守《实验动物管理条例》，每天人工控制日照12h(8:00—20:00)，夜照12h(20:00—8:00)，动物在实验前均自由进食和进水。

1.2药品与试剂

红豆杉提取物(东阳市杰迩威生物科技有限公司，原东阳市成杰红豆杉开发有限公司，批号：20170913)；噻托溴铵喷雾剂[思力华能倍乐，上海勃林格殷格翰药业有限公司，批号：国J20120047；规格：0.22634mg·L-1(以噻托溴铵计)，每揿含噻托溴铵2.5g，每瓶60揿]；白沙烟(湖南中烟工业有限责任公司，焦油10mg，烟碱1.0mg，一氧化碳13mg);BSA(德国SigmaAldrich);30%H2O2(国药集团化学试剂有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号：20171208；规格：100T/96样)、谷胱甘肽(GSH)试剂盒(批号：20171205；规格：100T/96样)、髓过氧化物酶(MPO)试剂盒(批号：20171219；规格：100T/48样)均来自南京建成生物工程研究所；小鼠TNF-、KC、MIP-2ELISA试剂盒(Duoset,R&DSystems，批号分别为840143,840171,840135)；磷酸缓冲盐溶液、无水乙醇、氯化钠、磷酸盐(市售分析纯试剂，国药集团化学试剂有限公司)。

1.3仪器

TE-10型香烟烟雾暴露装置(TeagueEnterprises，美国)；立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；N085PariBoy雾化吸入器(德国百瑞有限公司)；AG245型电子天平(瑞典MettlerToledo);905-ULTS型低温冰箱(美国ThermoScientific);F6/10型匀浆机(德国FLUKO);HH-W-420型数显恒温三用水箱(国旺实验仪器厂)；D3024R型冷冻离心机(美国SLICOGEM);AF100型制冰机(美国Scontman);EG1150H型石蜡包埋机、RM2135型轮转式石蜡切片机均来自德国Leica;CX31型光学显微镜(日本Olympus);ELX800UXBio-tek酶标仪(美国instrument);NanoDrop2000微量紫外分光光度计(美国Thermo)；涡旋混合器(其林贝尔制造有限公司)。

2、方法

2.1分组

将60只小鼠随机分为正常组、模型组、噻托溴铵组和红豆杉高、低剂量组。正常组正常饲养，使用空气暴露；模型组用生理盐水灌胃；噻托溴铵组给予噻托溴铵雾化剂5μg·kg-1；红豆杉高、低剂量组分别灌胃给予红豆杉100,300mg·kg-1。

2.2小鼠吸烟模型的制备和给药方法

参考文献[17,18]，除空白组外，各组小鼠均在给药结束0.5h后进行烟雾暴露。每个循环10支烟，每天10个循环，烟全部吸完再闷1h后取出小鼠，共造模93d。暴露装置中，总悬浮颗粒物的含量为0.16～0.18mg·L-1,CO浓度为400～500ppm。

2.3对吸烟模型小鼠的影响

小鼠末次攻击后24h眼球采血处死。结扎右肺，暴露气管行气管插管，用生理盐水0.5mL分2次进行支气管肺泡灌洗，混匀后进行细胞总数计数，以250×g离心10min，取细胞沉淀涂片，晾干后行HE染色，每个标本计数白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和单个核细胞(巨噬细胞)的比例，记录各自的百分比，并计算得到各类细胞绝对值。取右下肺叶用中性福尔马林液固定，做石蜡切片，进行HE染色和AB/PAS染色；取右肺中、下叶，放入-80℃保存，用于SOD、GSH、MPO活性和TNF-、KC、MIP-2表达量的测定。

2.3.1白细胞计数及白细胞分类计数

取50μL支气管肺泡灌洗液(BALF)加入450μL白细胞计数液，用低倍镜计数4个大格白细胞数量，根据“白细胞总数/mL=4个大格白细胞总和/4×20×104”计算白细胞总数。用高倍镜观察瑞氏吉姆萨染片，计数200个白细胞中中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞的数目。

2.3.2石蜡切片制作及HE染色

取置于4%甲醛溶液中进行固定的右下肺组织，常规脱水、透明、浸蜡、包埋。切片厚度4m，常规脱蜡、脱水、透明，苏木素染色30s，自来水冲洗1min，伊红着色l0s，再进行常规脱水、透明，最后滴加中性树胶封片。对每只小鼠HE染色的切片进行分析。染色切片按相似气管和血管周围炎症细胞浸润数目进行评分。

2.3.3AB/PAS染色

切片脱蜡至水、水洗、高碘酸染色、水洗Schiff液染色、偏重亚硫酸钠作用、流水冲洗，苏木精复染，水洗，蓝化，透明，最后滴加中性树胶封片。以染色观察气道的黏液分泌，蓝色提示为酸性黏液，紫红色提示为中性黏液。黏液评分以阳性的杯状细胞数占整个气道上皮细胞数的百分比表示。评分标准如下：0分，<5%;1分，5%～25%;2分，25%～50%;3分，50%～75%;4分，>75%。这些炎症以及黏液的评分均在不知情的研究人员单独完成，即采取单盲法。

2.3.4肺组织匀浆制备及SOD和GSH活性、MDA含量的测定

从-80℃冰箱中取出右肺中下叶样本，置于冰上，称重(mg)并记录，匀浆后离心，取上清液，按各试剂盒要求检测SOD、GSH活性和MDA含量。

2.3.5肺组织中TNF-、KC、MIP-2的表达

采用ELISA法测定，按说明书操作。用酶标仪在450nm下测定(室温；20min)，记录测量结果并进行分析。

2.3.6MPO酶学动力测定法

依次新鲜配置Homogenate Buffer和Assay Buffer，配完置于冰中，现配现用。每个EP管加30µLHomogenateBuffer，充分混匀，12000r·min-(16)离心10min。取上清于排管，冰上按每孔5µL加入96孔酶标板，每样本3个复孔。开启酶标仪，于酶标仪边上，按每孔250µL加入Assay Buffer，迅速(15min内)在460nm下测定OD值。

2.4统计学处理

所有数据用SPSS10.0统计软件处理，实验数据用s表示，各组均数先行方差齐性检验，各样本均数的比较采用方差分析和两样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1红豆杉提取物对小鼠的影响

熏烟小鼠的BALF白细胞总数较正常组明显升高，红豆杉提取物有一定降低白细胞总数的作用，但没有明显的量效关系。同时阳性对照药物噻托溴铵也有一定抑制白细胞渗出的作用。红豆杉低剂量组作用强度与噻托溴铵雾化组相当。结果见图1。

图1红豆杉提取物对COPD小鼠支气管肺泡灌洗液中白细胞总数的影响

3.2红豆杉提取物对肺组织病理改变的影响

熏烟后肺组织病理切片可见明显炎症改变，气道、血管周围及组织间隙均可见炎症细胞围绕；红豆杉提取物对肺大泡的形成及气道、血管周围及组织间隙的炎症细胞有一定抑制作用。噻托溴铵组也有一定抑制作用，与低剂量红豆杉提取物相当。结果见图2～3。

3.3红豆杉提取物对肺组织匀浆中SOD活性的影响

与正常组相比，模型组SOD含量显著降低(P<0.05)；与模型组相比，红豆杉提取物低、高剂量均具有明显增加SOD含量的作用(P<0.05)，作用强度与噻托溴铵相当。结果见图4。

3.4红豆杉提取物对肺组织匀浆中MPO活性的影响

测定10%的肺组织匀浆中MPO的活性，结果表明，与正常组相比，吸烟诱导的COPD模型肺组织匀浆中MPO活性明显上升(P<0.05)，低剂量红豆杉提取物具有抑制MPO活性的作用(P<0.05)，噻托溴铵的作用与低剂量红豆杉提取物相当。结果见图5。

3.5红豆杉提取物对肺组织匀浆中GSH活性的影响

与模型组相比，高、低剂量红豆杉提取物均有增加GSH含量的作用(P<0.05)，作用强度优于噻托溴铵组。结果见图6。

3.6红豆杉提取物对肺组织匀浆中细胞因子含量的影响

与正常组相比，吸烟诱导的COPD肺组织匀浆中细胞因子含量明显上升；与模型组比较，红豆杉提取物能降低MIP-2的含量，但作用强度较弱，未见统计学差异，而噻托溴铵组作用不明显。高剂量红豆杉提取物能够显著抑制KC炎症因子的分泌(P<0.05)；高、低剂量红豆杉提取物均可显著抑制TNF-的表达(P<0.05)，作用强度均优于噻托溴铵。结果见图7。

4、讨论

COPD属于全身性的炎症反应性疾病。在COPD病情发展过程中，体内炎性细胞因子可逐渐在气道内以及肺部组织中积聚，其中TNF-主要由活化后的巨噬细胞产生，属于前炎症因子，其激活后还可以刺激肺内的其他细胞产生更多的细胞因子，如MIP-2、KC的产生，从而放大局部的炎症反应，而炎症细胞的激活又能反过来增加内源性氧化物释放、加剧氧化应激反应，破坏氧化与抗氧化能力的平衡，造成患者的肺部结构破坏，致肺血管发生重构。因此炎性因子含量的显著增高、机体抗氧化能力下降可能是导致COPD患者出现肺动脉高压、慢性肺损害以及肺部功能减退等严重并发症的主要原因[19,20,21,22,23]。

图2组织病理图

图3红豆杉提取物对COPD小鼠肺组织中炎症病理变化的影响

图4红豆杉提取物对COPD小鼠肺组织匀浆中SOD含量的影响

图5红豆杉提取物对COPD小鼠肺组织匀浆中MPO活性的影响

图6红豆杉提取物对COPD小鼠肺组织匀浆中GSH含量的影响

图7红豆杉提取物对COPD动物模型肺组织匀浆中细胞因子含量的影响

本研究结果发现，对烟雾诱导的COPD小鼠，其肺组织病理切片可见明显炎症改变，气道周围、血管周围及组织间隙均可见炎症细胞围绕，而红豆杉提取物能降低炎性细胞因子MIP-2的含量，显著抑制KC炎症因子的分泌和TNF-的表达，对于肺大泡的形成及气道周围、血管周围及组织间隙的炎症细胞均有一定抑制作用，提示该提取物对COPD患者可能具有良好的抗炎作用。

氧化应激是已经被公认的COPD的发病机制之一，针对氧化应激这一发病机制使用药理抗氧化剂或促进内源性抗氧化剂水平，被认为是治疗COPD的有效方法。目前认为GSH是肺部和全身抵抗氧化应激的关键抗氧化剂，SOD是重要的肺部抗氧化酶。而MPO氧化应激损伤后中性粒细胞聚集释放的产物，可引发气道黏液高分泌和肺气肿。本研究中，吸烟诱导的COPD模型小鼠肺组织匀浆中GSH含量及SOD活性均显著降低，MPO活性明显升高。给药后，GSH含量及SOD活性均显著升高，而MPO活性被明显抑制，表明红豆杉提取物具有提高SOD活性，增加GSH含量，抑制MPO的作用。

本研究采用经典的香烟烟雾3个月暴露模型，基本上反映了COPD的病理特征，相当于COPDⅠ期或Ⅱ期水平，而晚期病变如肺气肿、肺纤维化等则需要更长时间建模[24,25]。本研究通过对模型小鼠肺组织病理切片及肺组织匀浆中多种炎症趋化因子TNF-、MIP-2、KC等的检测，以及氧化应激时SOD、GSH、MPO活力的测定，较全面地评价了减毒红豆杉提取物的药效，初步探讨了其作用机制，为进一步开发红豆杉提供了理论依据。

综上所述，红豆杉提取物对COPD动物模型有一定的治疗效果。红豆杉提取物能抑制COPD动物肺大泡的形成，对于气道周围、血管周围及组织间隙的炎症细胞以及肺组织中黏液分泌也有一定抑制作用。红豆杉提取物能明显增加GSH、SOD等含量，显著降低TNF-、KC等炎症因子以及肺组织MPO活性的作用，作用强度优于或相当于阳性药噻托溴铵雾化剂。

以上结果表明红豆杉提取物对COPD动物模型的作用机制可能与抑制中性粒细胞迁移、抑制炎症细胞因子的产生、抑制黏液分泌及抗氧化应激损伤有一定关系。

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基金:浙江省中医药管理局重点项目(2012ZZ009)