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小鼠免疫性肝损伤受阿魏酸对刀豆蛋白A诱导的保护作用研究

2020-07-18 232 上传者：管理员

摘要：探讨阿魏酸(ferulic acid, FA)对刀豆蛋白A (concanavalin A, Con A)诱导的免疫性肝损伤是否有保护作用。将雄性Balb/c小鼠随机分成6组：空白组、阿魏酸对照组(100 mg/kg)、模型组(15 mg/kg Con A)、低剂量阿魏酸干预组(10 mg/kg)、中剂量阿魏酸干预组(30 mg/kg)、高剂量阿魏酸干预组(100 mg/kg)。阿魏酸灌胃后，尾静脉注射刀豆蛋白A 15 mg/kg,24 h后，取其血和肝组织进行检测。与空白组比较，模型组中苏木精和伊红染色(HE)坏死区域明显增加，丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平、半胱天冬氨酸酶3 (Caspase-3)活性、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)水平、CD4+T细胞中CD69的表达都明显增高。与模型组相比，阿魏酸干预组的ALT和AST水平明显降低，呈剂量依赖性，HE坏死区域减少，Caspase-3活性、TNF-α和IFN-γ水平、CD4+T细胞CD69的表达都明显降低，且具有统计学意义。表明阿魏酸对刀豆蛋白A诱导的免疫性肝损伤有保护作用，其机制可能是抑制CD4+T淋巴细胞的活化、细胞因子的释放，减轻炎症和肝组织的凋亡。

关键词：
CD4+T淋巴细胞
免疫性肝损伤
凋亡
刀豆蛋白A
小鼠
炎症
阿魏酸
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乙型肝炎是乙型由肝炎病毒(HBV)导致的急性或慢性肝炎，可能发展为肝硬化，甚至进一步发展为肝细胞癌，已成为危害全球健康的常见疾病之一(Jung and Pape,2002;van der Molen et al.,2004)。HBV感染后，激活免疫系统抵抗病毒，然而强烈的免疫反应导致肝脏损伤(Kajiya et al.,2009)。目前，免疫介导的肝脏损伤通常接受免疫抑制治疗(泼尼松龙,布地奈德和经典硫唑嘌呤)，但是，免疫抑制治疗会使免疫力受损和内分泌系统紊乱，疗效相对有限(Strassburg and Manns,2011;Janmohamed and Hirschfield,2016)。因此寻找针对免疫性肝损伤有效的药物具有重要意义。

阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸,Ferulic acid,FA)是一种酚类化合物，分子量为194.19，化学式为C10H10O4。阿魏酸来源丰富，广泛存在于各种水果、蔬菜和中药中，阿魏酸有多种生理活性，能清除自由基，抑制免疫细胞释放炎症介质，具有抗氧应激和抗炎等作用(Srinivasan et al.,2007;Ghosh et al.,2017)。近几年的研究表明，阿魏酸对由缺血再灌注损伤诱导的肝细胞凋亡、四氯化碳引起的肝损伤，对乙酰氨基酚导致的肝毒性、酒精诱导的肝损伤等具有改善作用(Kanski et al.,2002;Chotimarkorn and Ushio,2008;Kim and Lee,2012;Yuan et al.,2016)。然而，阿魏酸对免疫性肝损伤是否有改善作用，还尚未研究。

刀豆蛋白A诱导的肝损伤，是一种主要由T细胞介导的细胞因子失调的免疫性肝损伤，能模拟许多病毒性肝炎和自身免疫性肝炎的病理学特征，是目前运用较广泛的免疫性肝损伤模型(Tiegs et al.,1992;Wang et al.,2012)。因此，本研究运用刀豆蛋白A诱导的免疫性肝损伤模型，来探讨阿魏酸对乙型病毒性肝炎是否具有保护作用，以及可能存在的作用机制。

1、结果与分析

1.1阿魏酸对刀豆蛋白A诱导的小鼠血清转氨酶活性的影响

阿魏酸对照组与空白组比较，小鼠血清中ALT、AST水平无统计学差异；模型组与空白组比较，小鼠血清中ALT、AST水平明显升高；10 mg/kg、30 mg/kg、100 mg/kg阿魏酸干预组与模型组比较，小鼠血清中ALT、AST水平依次降低，呈剂量依赖性。可见，阿魏酸对刀豆蛋白A诱导的小鼠肝损伤具有改善作用，且在100 mg/kg此剂量时，ALT、AST水平降低最明显，因此，在后续的实验中，本研究都选用此剂量来做研究(图1)。

1.2阿魏酸对刀豆蛋白A诱导的小鼠肝脏组织病理改变的影响

HE染色结果显示，空白组和阿魏酸对照组小鼠肝脏的结构清晰、完整，中央静脉位于肝小叶中间，肝细胞在中央静脉周围呈放射状排列，肝血窦无扩张。模型组与空白组相比，小鼠的中央静脉周围肝细胞呈大片凝固性坏死，肝血窦扩张、充血及出血明显。高剂量阿魏酸干预组与模型组相比，小鼠中肝细胞坏死明显减少，病理改变较模型组明显减轻。表明阿魏酸对刀豆蛋白A诱导的小鼠免疫性肝损伤的组织形态具有一定的保护作用(图2)。

1.3阿魏酸对刀豆蛋白A诱导的小鼠肝细胞凋亡的影响

阿魏酸对照组与空白组对比，小鼠肝组织中Caspase-3活性无统计学差异；模型组与空白组比较，小鼠肝组织中Caspase-3的活性显著升高；高剂量阿魏酸干预组与模型组比较，小鼠肝组织中Caspase-3的活性明显降低(p<0.01)，表明阿魏酸对刀豆蛋白A诱导的小鼠肝损伤具有一定的抗凋亡作用(图3)。

1.4阿魏酸对刀豆蛋白A诱导的小鼠炎症细胞因子的影响

阿魏酸对照组与空白组比较，小鼠血清中的TNF-α和IFN-γ水平无统计学差异；模型组与空白组比较，小鼠血清中TNF-α和IFN-γ明显升高；高剂量阿魏酸干预组与模型组比较，小鼠血清中TNF-α和IFN-γ都明显降低(p<0.01)。表明阿魏酸对刀豆蛋白A诱导的小鼠肝损伤的保护作用，可能与细胞因子的减少有关(图4)。

1.5阿魏酸对刀豆蛋白A诱导的小鼠CD4+T淋巴细胞活化的影响

阿魏酸对照组(1.01%)与空白组(1.57%)比较，小鼠的CD4+T淋巴细胞中CD69分子表达都很低；模型组(40.2%)与空白组比较，小鼠中CD4+T淋巴细胞CD69分子呈高表达；高剂量阿魏酸干预组(15.5%)与模型组比较，小鼠中CD4+T淋巴细胞CD69分子表达明显降低。表明阿魏酸对刀豆蛋白A诱导的小鼠肝损伤的保护作用可能与抑制CD4+T淋巴细胞的活化有关(图5)。

图1阿魏酸对刀豆蛋白A诱导的小鼠血清转氨酶活性的影响(n=6)

图2阿魏酸对刀豆蛋白A诱导的小鼠肝脏组织病理改变的影响(×200)

2、讨论

中国是乙型肝炎高流行区，在慢性乙型肝炎病毒感染者中，约有15%～25%患者最终死于肝硬化、肝癌等乙型肝炎病毒相关的肝病。目前，刀豆蛋白A诱导的免疫性肝损伤模型，能很好地模拟病毒性肝炎的病理学特征，为寻找乙型肝炎治疗方法提供了方便。当刀豆蛋白A经尾静脉注入小鼠体内后，大量T细胞在肝脏渗出，产生TNF-α和IFN-γ等炎症介质，导致肝细胞凋亡和坏死、血清转氨酶升高(Tiegs,2007)。ALT和AST为临床诊断和实验研究最常见的肝损伤标志(McGill,2016)。在研究结果中，发现阿魏酸预处理后，刀豆蛋白A诱导的肝损伤小鼠血清中ALT、AST水平明显下降，且病理改变中坏死区域明显减少，表明阿魏酸对刀豆蛋白A诱导的免疫性肝损伤的肝功能和形态具有保护作用。

肝细胞凋亡是导致肝损伤的关键步骤(Malhi et al.,2010)。有研究表明，给小鼠注射刀豆蛋白A会导致肝细胞凋亡增加(Fayad et al.,2005)。而阿魏酸在脑缺血再灌注中能减少海马神经细胞凋亡(Ren et al.,2017)。因此，本研究推测阿魏酸对刀豆蛋白A诱导的肝损伤的保护作用可能与抗凋亡有关。Caspase-3具有剪切管家蛋白和DNA片段的功能，是参与凋亡途径的关键效应分子，被称为细胞凋亡的执行者(MacKenzie and Clark,2012)。所以本研究检测了肝组织中的Caspase-3活性。在本研究结果中，阿魏酸预处理后，刀豆蛋白A诱导的肝损伤中Caspase-3活性明显降低，表明肝细胞凋亡减少，因此，阿魏酸可能是通过减少肝细胞的凋亡，对刀豆蛋白A诱导的免疫性肝损伤具有保护作用。

图3阿魏酸对刀豆蛋白A诱导的小鼠肝细胞凋亡的影响(n=6)

促炎细胞因子如TNF-α和IFN-γ在刀豆蛋白A诱导的肝损伤的发展过程中起着重要作用(Gantner et al.,1995;Darwish et al.,2015)。有文献报道，在IFN-/-或TNF-/-小鼠中，刀豆蛋白A诱导的免疫性肝损伤的程度明显减轻(Tagawa et al.,1997;Wolf et al.,2001)。使用抗TNF-α或IFN-γ的抗体后也能减轻刀豆蛋白A诱导的肝损伤(Streetz et al.,2001)。本研究结果中，在刀豆蛋白A诱导的免疫性肝损伤中，阿魏酸的预处理使TNF-α和IFN-γ水平明显下降，肝损伤减轻，表明阿魏酸可能是通过减少促炎细胞因子的产生来改善刀豆蛋白A诱导的免疫性肝损伤。

细胞因子的产生与白细胞的活化密切相关。活化的白细胞如CD4+T淋巴细胞等主要效应细胞，产生过量的TNF-α和IFN-γ，参与了刀豆蛋白A诱导的肝损伤(Tiegs et al.,1992;Robinson et al.,2009)。CD69是T淋巴细胞活化的标记分子，本研究通过流式细胞术标记CD4、CD69 2种分子对T淋巴细胞进行分析，研究结果显示在阿魏酸预处理后刀豆蛋白A诱导的CD4+T淋巴细胞中CD69的表达明显降低，表明阿魏酸能抑制CD4+T淋巴细胞的活化。因此，阿魏酸对刀豆蛋白A诱导的免疫性肝损伤的保护作用，可能与抑制CD4+T淋巴细胞的活化有关。

图4阿魏酸对刀豆蛋白A诱导的小鼠炎症细胞因子的影响(n=6)

综上，阿魏酸对刀豆蛋白A诱导的免疫性肝损伤具有保护作用，其机制可能是通过抑制CD4+T淋巴细胞的活化、细胞因子的释放，减轻炎症和肝组织的凋亡。因此，阿魏酸可能为临床上治疗乙型肝炎提供一个新的治疗方法。

图5阿魏酸对刀豆蛋白A诱导的小鼠CD4+T淋巴细胞活化的影响

3、材料与方法

3.1材料

实验动物：清洁级8周雄性Balb/c小鼠，体重18～22 g，购于重庆医科大学动物中心，动物使用许可证号：SYXK(渝)2015-0001。小鼠先适应环境1周，12 h昼夜循环光照，自由饮食。实验过程中，动物的处理方式严格遵循动物实验伦理学的要求。

药品与试剂：阿魏酸(ferulic acid,FA)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司(纯度>99%)。刀豆蛋白A(concanavalin A,Con A)购于Sigma-Aldrich公司。丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。苏木精和伊红(HE)购于美国Amresco公司。半胱氨酸天冬氨酸酶-3(Caspase-3)活性检测试剂盒购于碧云天生物技术研究所。FITC标记的大鼠抗小鼠的CD4和PE标记的仓鼠抗小鼠的CD69购于BD公司，干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒购于Bender Med Systems，Ⅰ型胶原酶购于美国Worthington生化公司。

主要仪器：移液器，美国Axygen公司；DS-Fil显微镜，日本Nikon公司；-80℃低温冰箱，美国Thermo公司；BioTek-ELX800全自动酶标仪，美国Biotek仪器公司；BD Influx分选型流式细胞仪，美国BD公司。

3.2动物分组及处理

将体重为18～22 g的雄性Balb/c小鼠随机分为6组，每组6只：空白组(Blank)、阿魏酸对照组(FA)、模型组(Model)、低剂量阿魏酸干预组(Low dose FA)、中剂量阿魏酸干预组(Medium dose FA)、高剂量阿魏酸干预组(High dose FA)。阿魏酸用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶解为混悬液后灌胃给药。模型组小鼠尾静脉注射刀豆蛋白A 15 mg/kg，空白组小鼠尾静脉注射相同剂量的生理盐水，阿魏酸对照组和低、中、高剂量阿魏酸干预组提前一天阿魏酸灌胃，剂量分别为100 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg、100 mg/kg,8 h/次，连续3次，且低、中、高剂量阿魏酸干预组小鼠均于末次灌胃30 min后，尾静脉注射刀豆蛋白A15 mg/kg。24 h后，摘眼球取血，检测肝功能，取肝脏进行形态学、凋亡蛋白酶及免疫细胞的检测。

3.3血清转氨酶活性测定

摘小鼠眼球取血，将血离心5 min(3 000 r/min)，吸上清液，于-80℃冰箱保存待测。血清转氨酶ALT和AST的测定，按照试剂盒说明书的步骤进行。用酶标仪测得波长为520 nm处的吸光值，计算ALT和AST的含量。

3.4 HE染色

将肝脏组织切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小，4%多聚甲醛固定24 h后，酒精梯度脱水，石蜡包埋，组织切片为5 m，苏木精-伊红染色后，正置荧光显微镜下拍片。

3.5肝脏组织中凋亡蛋白酶检测

先将肝脏组织研磨为匀浆液，离心(4℃,16 000 g,10 min)，得上清液。按照试剂盒说明书加入裂解液和Ac-DEVD-pNA，用酶标仪测得波长为405 nm处的吸光值，计算Caspase-3含量。

3.6血清细胞因子的检测

采用IFN-γ和TNF-α的ELISA试剂盒检测IFN-γ和TNF-α的水平，先把肝脏组织匀浆，然后按照说明书准备抗体及标准品，再根据实验步骤操作，分别测得酶标仪450 nm、560 nm处吸光值，根据标准曲线计算IFN-γ和TNF-α含量。

3.7淋巴细胞分型检测

将离体肝脏用0.05%Ⅰ型胶原酶灌注，剪碎肝脏，37℃消化30 min，低速离心(50 g,5 min)，去除肝细胞，再高速离心(300 g,15 min)，倒掉上清液，加入PBS混匀，计数板计数后，将样本浓度稀释为105个/mL，加入FITC标记的大鼠抗小鼠的CD4和PE标记的仓鼠抗小鼠的CD69各0.5 L，孵育30 min后，用BD Influx分选型流式细胞仪检测样本。

3.8统计学方法

应用SPSS软件进行统计学分析，实验结果均采用t检验，所有数据都以均数±标准差(±s)来表示，统计结果以p<0.05时认为其差异具有统计学意义。

周琴,马莉,蒋序杰,万敬员,王彬.阿魏酸对刀豆蛋白A诱导的小鼠免疫性肝损伤的保护作用[J].基因组学与应用生物学,2020,39(04):1852-1858.

基金:国家自然科学基金(No.81373870);卫生部国家临床重点专科建设项目[财社(2011)170号];重庆市医学重点学科(渝卫科教(No 2007)2号)共同资助