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小鼠抑郁样行为与尿素通道蛋白B敲除小鼠脑组织水通道蛋白4表达改变的关系研究

2020-07-18 226 上传者：管理员

摘要：目的探讨尿素通道蛋白B(UT-B)敲除小鼠海马超微结构改变，以及水通道蛋白4(AQP4)的表达变化，探讨形态改变与小鼠抑郁样行为的关系。方法采用糖水偏好和强迫游泳实验检测野生型与UT-B敲除小鼠(各10只)的行为差异，透射电子显微电镜观察小鼠海马组织的超微结构改变，免疫组织化学观察脑组织AQP4的表达，免疫印迹技术检测AQP4表达水平。结果野生型小鼠与UT-B基因敲除小鼠糖水偏好指数分别为(84.67±4.85)%和(65.67±7.97)%(P<0.001)，而强迫游泳实验不动时间分别为(128.56±11.24)s和(209.11±20.99)s(P<0.001);两种行为学检测结果显示，UT-B敲除小鼠表现出抑郁样行为。电子显微镜结果显示，敲除小鼠出现神经元神经纤维肿胀和退行性改变，血管周围星形胶质细胞终足肿胀。免疫组织化学结果显示，敲除小鼠脑皮质、海马、丘脑等部位AQP4免疫阳性细胞数量明显减少，AQP4免疫阳性细胞主要分布于软脑膜、室管膜及脑血管周围，但脑血管周围免疫染色减弱。免疫印迹法检测提示，海马组织中AQP4表达水平下调27.1%(P<0.05)。结论 UT-B基因敲除小鼠脑皮质和海马AQP4表达减少，可能通过影响神经发生和脑代谢引起小鼠的抑郁样行为。

关键词：
免疫印迹法
小鼠
尿素通道蛋白B
抑郁
水通道蛋白4
透射电子显微术
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星形胶质细胞是神经系统中数量最多的细胞，对神经元起支持、营养、代谢、保护等作用。且越来越多的证据表明，星形胶质细胞参与了神经兴奋性传递和突触可塑性等重要的生理过程，其结构的异常或功能的改变与包括抑郁在内的多种神经、精神疾病的发病密切相关[1,2,3,4]。近年来对星形胶质细胞在抑郁发病机制的研究显示，大量表达于星形胶质细胞膜上的水通道蛋4(aquaporin4,AQP4)基因突变或蛋白表达异常与抑郁发病密切相关;AQP4缺失通过引起脑部类淋巴系统功能障碍，海马神经元发生下降和脑源性神经营养因子减少等途径，参与神经递质释放，神经发生和突触可塑性调节，成为目前抑郁症机制研究的热点之一[5,6,7,8,9,10]。本课题组前期工作显示，尿素通道蛋白B(UT-B)基因敲除小鼠具有抑郁样行为，但具体机制不明[11]。UT-B是一种特异性介导尿素分子快速跨膜转运的膜蛋白[12]，其在体内广泛分布于红细胞、肾脏等部位，在神经系统中UT-B和AQP4均表达于星形胶质细胞膜;两者功能具有相似性，均可调节水分子跨膜转运，维持脑组织渗透压。UT-B基因敲除是否对AQP4的表达和功能产生影响，以及这一改变与UT-B基因敲除小鼠抑郁行为之间的相关性值得探讨。为此，本研究通过糖水偏好和强迫游泳实验，观察野生型和UT-B基因敲除小鼠的行为表现，采用电子显微镜比较两组小鼠脑组织超微结构差异，免疫组织化学和免疫印迹技术分别检测AQP4的表达特征和水平，探讨UT-B敲除对小鼠脑组织AQP4表达的影响，为深入研究UT-B蛋白在抑郁症病理机制中的作用提供实验依据。

材料和方法

1．材料

8～12周龄重量匹配、雌雄不拘的野生型和UT-B基因敲除小鼠各10只(遗传背景为C57)，由北京大学杨宝学教授馈赠，动物合格证号:SCXK(渝)2018-0003。

2．方法

2.1行为学检测:糖水偏好实验(SPT)反映抑郁症状中快感的缺失，快感缺失是指对奖励刺激缺乏兴趣，为抑郁症的核心症状之一[13]。糖水偏好测试之前对实验小鼠禁食禁水24h，之后进行12h糖水偏好测试。实验期间，每只小鼠预先称重1瓶1%糖水(w/v)和1瓶白水;6h后交换瓶子位置，以排除小鼠对饮水的位置(左/右)偏好;待实验结束，称重2瓶水的重量，计算小鼠的糖水偏好。糖水偏好指数(%)=糖耗水量/(糖耗水量+纯水消耗量)×100%。

强迫游泳实验(FST)是测试评价啮齿类动物抑郁绝望行为的经典实验[14]。将小鼠垂直放入水中，小鼠会自主地挣扎并积极逃亡，如跳跃、游泳或潜水，但随着测试时间延长，小鼠会不动漂浮于水面，这种不动即被认为是绝望和抑郁的表现，不动时间越长，表明抑郁越严重。实验装置:直径14cm，高20cm的有机玻璃缸，向内注入温度为(25±1)℃的自来水至水深(10±1)cm。本实验共进行6min，记录后4min小鼠的不动时间(绝望时间)。实验结束后将小鼠于30℃条件下烘干并放回笼，须更换缸内的水，避免对后续实验小鼠产生警示信号而影响其行为。

2.2透射电子显微镜技术:采用3%戊巴比妥钠(85mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，先后以生理盐水和4%戊二醛经左心室灌注。取小鼠前内侧额叶皮质切成1cm3小块，采用2.5%戊二醛和1%锇酸固定，缓冲液漂洗后，乙醇及丙酮脱水。电子显微镜环氧树脂组织包埋试剂盒包埋，切片，修片，超微切片及染色后，透射电子显微镜观察。

2.3免疫组织化学检测AQP4蛋白的表达变化:野生型和AQP4基因敲除小鼠各3只，按上述方法麻醉后采用左心室生理盐水冲洗及4%多聚甲醛灌注固定后断头，取完整大脑入4%多聚甲醛后固定24h,20%蔗糖脱水后常规石蜡包埋做连续冠状切片，片厚6μm。石蜡切片经二甲苯和梯度乙醇脱蜡水化后，采用0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)修复抗原，山羊血清工作液以封闭非特异性结合位点，37℃30min;滴加兔AQP4多克隆抗体(Millipore公司，1∶500)4℃过夜;0.01mol/LPBS漂洗后，滴加生物素标记的山羊抗兔IgG(1∶3000),37℃孵育1h;0.01mol/LPBS漂洗后，滴加SP工作液，37℃孵育30min,0.01mol/LPBS漂洗，DAB显色后苏木素复染细胞核，脱水，透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察结果。取相同量的正常羊血清代替AQP4抗体，其余步骤同上。阴性对照未见阳性染色，阳性结果为胞膜呈棕黄色，胞质及胞核未见阳性染色。

2.4免疫印迹法检测AQP4蛋白的表达水平:野生型和UT-B基因敲除小鼠各3只，按照前述方法麻醉后断头处死，取50mg海马组织放入预先装有匀浆介质的匀浆器中，冰上匀浆至组织溶解，匀浆装入1.5ml离心管中1500×g离心5min，将上清液再次10000×g离心30min,4℃，取上清液并测定蛋白浓度。将备好的样品按60μg蛋白/道上样于10%SDS-PAGEgels(Invitrogen公司)，加入电泳缓冲液，120mV,2.5h;按常规电转移步骤将蛋白转至PVDF膜;经5%脱脂牛奶封闭1h后，用5%BSA/TBST缓冲液稀释的兔AQP4多克隆抗体(1∶1000)和鼠抗β-actin抗体(1∶1000)孵育2h;TBST漂洗后用5%脱脂牛奶/TBST缓冲液稀释的二抗(1∶10000)孵育1h;TBST漂洗后ECL避光孵育15min，用保鲜膜完全包裹免疫印迹膜，去除皱褶。用胶带将免疫印迹膜固定在暗盒内，蛋白带面向上，暗房内压X线胶片，曝光，显影，冲洗。

2.5统计学分析:所有数据以均值±标准差表示，采用SPSS25.0统计学软件，对成组数据进行t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

1．行为学观察结果

UT-B敲除导致抑郁样行为发生。由图1糖水偏好和强迫游泳实验结果可见，野生型小鼠与UT-B基因敲除小鼠糖水偏好指数分别为(84.67±4.85)%和(65.67±7.97)%，而强迫游泳不动时间分别为(128.56±11.24)s和(209.11±20.99)s;两种抑郁行为测试结果显示，UT-B基因敲除小鼠表现出抑郁样行为，差异具有统计学意义(P<0.001)。

2．脑组织超微结构变化

野生型小鼠海马的超微结构电子密度均匀，结构正常(图2A～2C)。UT-B基因敲除小鼠的海马中可见有髓神经纤维及无髓神经纤维(图2D)水肿和退行性变，即空泡样改变的疏松区域和髓样结构的出现;部分神经元出现核周间隙增宽及细胞器肿胀等胞质的改变(图2E);可见部分星形胶质细胞终足出现肿胀伴髓样结构形成，提示血脑屏障功能受损(图2F)。

3．免疫组织化学染色结果

野生型小鼠的软脑膜(图3A)、室管膜和脉络丛(图3B)、额叶皮质(图3C)、海马CA1区(图3D)、海马CA2/3区(图3E)和丘脑背内侧核(图3F)等处均可见表达丰富，轮廓清楚，胞膜呈棕黄色，胞核复染成蓝色的AQP4免疫阳性细胞，在血管周围表达尤为显著。UT-B基因敲除小鼠软脑膜(图3A1)、室管膜和脉络丛(图3B1)中AQP4免疫阳性细胞分布部位和染色程度与野生型小鼠相似，但额叶皮质(图3C1)、海马CA1区(图3D1)、海马CA2/3区(图3E1)和丘脑背内侧核(图3F1)各部位中AQP4免疫阳性细胞主要分布于脑血管周围，染色减弱，周围组织中阳性细胞密度明显减少，海马各亚区尤为明显。

4．免疫印迹法检测结果

两型小鼠海马中AQP4表达的免疫印迹结果显示，UT-B基因敲除小鼠AQP4蛋白表达水平较野生型小鼠下调约27.1%，差异具有统计学意义(P<0.05，图4)。

讨论

抑郁症是以情绪持久低落，思维迟钝，意志行为减少为主要特征的精神疾病，严重者伴有自杀倾向，已经成为目前最常见的心理疾病之一[15]。抑郁症的发病机制较为复杂，与遗传、神经生化、神经内分泌、心理社会等多种因素有关[16]。传统观点认为，额叶和颞叶皮质、海马等脑区神经元体积下降及功能改变是抑郁症主要的病理改变[17,18]。而近年来对星形胶质细胞膜上AQP4功能不断深入研究发现，其不仅与脑组织内液体的转运，脑组织的渗透压平衡密切相关，并且通过调节谷氨酸代谢，神经营养因子分泌等参与了神经信号传递及可塑性调节等生理过程;其表达缺失或减少在抑郁发生的过程中具有重要作用[5,6,7,8,9,10]。因此，对具有抑郁样行为动物脑组织中AQP4的表达部位及水平进行研究具有重要意义。

图1野生型和UT-B敲除小鼠抑郁行为测试结果

图2野生型小鼠(A～C)和UT-B基因敲除小鼠(D～E)海马超微结构特点

图3野生型小鼠和UT-B基因敲除小鼠脑组织中AQP4的表达免疫组织化学染色

图4野生型小鼠和UT-B基因敲除小鼠海马AQP4表达水平的比较

UT-B是特异性介导尿素顺渗透压快速跨膜转运的通道蛋白。本课题组前期工作显示，UT-B广泛分布于皮质、海马、垂体、小脑等区域的星形胶质细胞膜上，通过特异性地将脑组织中代谢产生的尿素排入脑脊液或脑血管，以维持脑组织内环境的稳定[11]。本研究采用野生型小鼠与UT-B基因敲除小鼠进行了抑郁样行为的检测。糖水消耗实验中，UT-B基因敲除鼠平均糖水消耗指数比野生型鼠少19%;而强迫游泳实验UT-B基因敲除鼠平均不动时间比野生型鼠多80.55s，差异具有统计学意义。两种实验分别显示了UT-B敲除鼠表现出快感缺失和绝望行为这两种抑郁症的核心症状，提示UT-B表达缺失可能与抑郁的发生有关。由于UT-B和AQP4都在脑组织水和渗透压的维持中发挥作用，那么UT-B基因敲除小鼠脑组织的超微结构改变和AQP4的表达变化值得探究。

UT-B基因敲除小鼠海马的电子显微镜结果显示神经元胞体和纤维出现轻微肿胀，毛细血管周围的星形胶质细胞终足轻度水肿并有髓样结构形成，提示UT-B基因敲除导致脑组织尿素蓄积，局部渗透压浓度升高，引起神经元和星形胶质细胞结构变化。免疫组织化学结果显示，两组小鼠脑组织各部位中AQP4免疫阳性细胞均为胞膜表达。不同的是，UT-B基因敲除小鼠脑组织中AQP4免疫阳性细胞变化分布具有区域差异;其中，软脑膜、室管膜、脉络丛、皮质和海马中脑血管周围的AQP4免疫阳性细胞数量并无明显减少，而脑皮质、海马各亚区中AQP4免疫阳性细胞数量显著减少，包括血管周围和神经元周围的神经毡;海马组织免疫印迹的结果证实了AQP4表达水平的下降。这一结果提示，AQP4表达改变的区域差异可能与功能变化相关。软脑膜、室管膜、脉络丛及脑血管周围AQP4的阳性表达与其转运水分子、维持渗透压平衡的功能相关，提示UT-B基因敲除小鼠脑组织内AQP4因局部渗透压增高促进水分子转运，导致神经元和胶质细胞出现轻微肿胀。脑皮质及海马各亚区是抑郁症病理变化出现的主要区域。大量临床和动物实验结果表明，额叶、海马等部位星形胶质细胞的数量减少是导致脑皮质变薄，海马萎缩的重要因素之一，与抑郁症的发生密切相关[16,18]。本实验相关的研究发现，UT-B基因敲除小鼠海马脑皮质及海马星形胶质细胞数量减少(结果未显示)，这一改变可能伴发AQP4的表达下降，继而可能影响到该区域的神经再生水平和突触可塑性而导致抑郁的发生。与此同时，我们还观察到，UT-B基因敲除小鼠脑血管周围AQP4免疫阳性程度较野生型小鼠降低，提示星形胶质细胞终足与脑血管的联系下降。研究发现，重度抑郁症患者灰质中，AQP4免疫阳性的星形胶质细胞终足覆盖脑血管比例的降低与抑郁的程度密切相关[19]，推测其可能通过影响灰质中的脑血流和局部代谢而引发抑郁。抗抑郁药氟西汀调节胶质细胞突起的可塑性具有AQP4依赖性，尤其是在血管周围，AQP4参与构建脑血流与脑实质之间的代谢和功能连接[20]。本课题组前期工作也发现，UT-B基因敲除小鼠的脑血流量降低[11]。由此可见，UT-B基因敲除小鼠脑血管周围AQP4的表达下调是导致抑郁样行为出现的重要原因。

综上所述，UT-B基因敲除小鼠脑皮质及海马中因星形胶质细胞数量减少引起的AQP4表达下调，以及脑血管周围星形胶质细胞终足的附着减少均与小鼠的抑郁样行为有关，而UT-B敲除如何引起AQP4表达改变的分子机制还有待于进一步研究。

参考文献：

[17]王贞,黄怡佳,乃爱桃,等.氟西汀通过上调海马内溴结构域蛋白4的表达改善慢性束缚应激所致小鼠的抑郁样行为[J].解剖学报,2019,50(1):18-23.

袁德智,侯良绢,田宽,胡玲,李晋芳,冉建华.尿素通道蛋白B敲除小鼠脑组织水通道蛋白4表达改变与抑郁样行为的关系[J].解剖学报,2020,51(03):326-331.

基金:国家自然科学基金(81770738);重庆市教育委员会科学技术研究项目(KJ1725384)