神经退行性变性疾病是指一系列以神经细胞的进行性退化和死亡为特征,随之发生运动功能障碍或精神障碍的疾病[1]。神经退行性变性疾病有慢性和急性之分,前者主要包括阿尔茨海默病、帕金森病、运动神经元病(也称肌萎缩侧索硬化)、亨廷顿病、皮克病等,后者主要包括脑卒中、脑外伤等。随着对神经退行性变性疾病的深入研究,发现氧化应激、线粒体功能障碍、兴奋性毒性、炎症和离子失衡等多种因素可加速或引发疾病[2]。近年来,神经退行性变性疾病的发病率越来越高,但是治疗手段十分有限。因此,明确神经退行性变性疾病的发病机制,是发现该疾病有效治疗手段的重要途径。

多腺苷二磷酸(ADP)核糖基化修饰(PARylation)对细胞的影响具有多样性,1963年由Chambon等首次报道,是一种消耗烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的新型蛋白质修饰方式[3]。多ADP核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]是介导PARylation的酶,其中PARP-1占PARP家族酶活性约80%[6]。20世纪90年代初至90年代中期,研究者们通过体外实验首次发现神经系统疾病中的神经损伤或神经毒性伴有PARP-1激活[4,5]。研究表明,PARP-1激活后,以NAD+为底物催化产生烟酰胺的同时,合成ADP核糖并将其转移至组蛋白、DNA修复蛋白、转录因子和PARP-1自身等底物蛋白,使底物蛋白发生PARylation[7]。PARylation通过空间效应和电荷效应改变底物蛋白的活性,最终在基因的修复与表达、蛋白质稳定性、细胞信号转导等方面发挥重要作用[8,9]。但是,PARylation并不稳定,多ADP核糖(PAR)聚合物极易被ADP核糖水解酶降解[10,11]。

PARylation参与脑卒中、帕金森症、阿尔茨海默病、运动神经元病等神经退行性变性疾病的发生发展,且PARylation抑制剂对神经退行性变性疾病具有保护作用,这为该类药物进入临床试验带来希望[1,9]。为深入研究PARylation与神经退行性变性疾病发病机制的关系,并寻找神经退行性变性疾病新型有效的治疗靶点,本文回顾了PARylation影响蛋白质功能和细胞凋亡的机制研究,阐明PARylation在几种重要神经退行性变性疾病中的作用。

1、多腺苷二磷酸核糖基化修饰通过调节蛋白质分子细胞内移位影响运动神经元病的进展

在95%以上运动神经元病患者中,参与调节核酸功能的RNA结合蛋白如核蛋白TARDNA/RNA结合蛋白43(transactive responseDNA/RNA-bindingprotein43,TDP-43)、融合蛋白和核内不均一核糖核蛋白(hnRNPA1)的核质转运发生异常[12,13]。研究发现,这些与疾病相关的RNA结合蛋白在含有RNA识别基序的同时也具有PAR的识别序列,其原因是PAR和核酸均具有多价阴离子的聚合结构。RNA结合蛋白可通过识别并结合PAR链,在PARP的催化下发生PARylation[14,15]。研究证实,运动神经元病患者的运动皮层、顶叶皮层和小脑的神经元、皮层下胶质细胞和巨噬细胞中的PARP-1蛋白水平均升高[16];脊髓中也检测到PARP-1增加[17],脊髓运动神经元细胞质中PAR水平没有变化,而细胞核中PAR水平升高[18]。在对果蝇的研究中发现,细胞质中PARP-5水平降低可以减少TDP-43在细胞质中的积累,减轻TDP-43的神经毒性[19]。在啮齿类动物的实验中发现,抑制细胞核的PARP-1/2可减轻神经元中TDP-43易位的神经毒性,并减少亚砷酸盐诱导的细胞质中TDP-43的积累[19,20]。同样,体外研究发现用过氧化氢处理激活PARP-1后,可引起融合蛋白发生PARylation,使用PARP-1/2抑制剂或增加多聚ADP核糖水解酶可抑制融合蛋白在细胞质的累积[21]。这表明PARP-1/2和PARP-5通过催化TDP-43和融合蛋白发生PARylation,调节这两个蛋白质的细胞核或细胞质的定位分布,从而影响运动神经元病的疾病过程。因此,研究者认为,若有药物让这些异常定位的核蛋白回归原位,将具有积极的治疗意义[12,13],因此PARP抑制剂是极具潜力的候选药物。

2、多腺苷二磷酸核糖基化修饰通过调节蛋白质聚集促进神经变性

α-突触核蛋白、β-淀粉样蛋白、τ蛋白和TDP-43等淀粉样蛋白异常聚集可活化PARP-1,导致PARylation水平升高,是阿尔茨海默病、帕金森病、运动神经元病等神经退行性变性疾病的常见病理特征[14]。此外,反应产物PAR和被PARylation的蛋白可作为募集淀粉样蛋白的成核中心,通过调节淀粉样蛋白的聚集动力学增加其局部浓度和细胞毒性[15,20]。

运动神经元病相关的RNA结合蛋白,如TDP-43和hnRNPA1,可通过其PAR结合的基序直接与PAR共价结合,发生PARylation后促进TDP-43和hnRNPA1的液-液相分离,更重要的是,可调节TDP-43和hnRNPA1向应激颗粒募集[15,16,17,18,19,20]。此外,PARylation不仅促进单独TDP-43或hnRNPA1发生液-液相分离,还促进TDP-43和hnRNPA1的共相分离,而细胞中PARylation水平降低可抑制两者之间相互作用和相分离[18]。在生理条件下,PARylation可调节相分离介导的各种RNA结合蛋白应激颗粒的装配和分解;而当PARP活性和PARylation水平异常时,激活PARP-1提高PAR的水平促进了应激颗粒的固化,使蛋白质和应激颗粒可以凝结成不可逆的淀粉样蛋白聚集,促进了神经变性,而PARP-1抑制剂可抑制hnRNPA1和TDP-43在细胞质的异常聚集和神经毒性[15,20]。

此外,帕金森病体内、外研究中也发现了类似结果。帕金森病细胞模型中α-突触核蛋白水平增加2～4倍可激活PARP-1[22]。用浓度递增的神经毒素如甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)处理原代培养的神经元,或诱导小鼠帕金森病模型,可引起多巴胺能神经元丢失,并伴有PARP-1激活和自身PARylation水平增加[23,24,25],导致PAR水平增高。增多的PAR可促进淀粉样蛋白α-突触核蛋白的聚集,PAR与α-突触核蛋白虽然也是共价结合,但研究者认为α-突触核蛋白并未发生PARylation。与正常小鼠相比,帕金森病小鼠中PAR诱导形成的α-突触核蛋白蛋白纤维结构更加紧密且不易被蛋白酶K消化。该蛋白纤维对原代培养的神经元和帕金森病小鼠具有更强的神经毒性[26]。这提示,PAR与α-突触核蛋白的结合导致更具毒性的α-突触核蛋白及其同系物的形成。若使用PARP-1抑制剂苯甲酰胺或敲除PARP基因后,小鼠对MPTP的毒性作用具有抗性[23,24]。可见,淀粉样蛋白的聚集与异常的PARylation水平之间构成了一个反馈环路。临床发现,帕金森病患者的脑脊液中PAR水平升高[26],提示未来可能可以通过干预蛋白PARylation治疗帕金森病等神经退行性变性疾病。

3、多腺苷二磷酸核糖基化修饰通过抑制蛋白质活性导致神经元代谢受损

NAD+作为氧化还原反应的辅酶,在细胞中发挥重要作用;作为ADP核糖的供体,在PARP-1激活时作为底物参与PARylation过程。以往认为,PARP-1激活导致的能量耗竭是由于NAD+过度消耗而引起。然而,后来的研究表明,PARP-1激活不仅可消耗NAD+,还可通过使蛋白质发生PARylation而导致生物能量的耗竭。

己糖激酶是糖酵解过程中的限速酶。研究表明,己糖激酶活性降低在阿尔茨海默病的氧化应激和神经变性中发挥至关重要的作用[27]。己糖激酶过表达可防止帕金森病小鼠模型中的神经变性[28]。此外,己糖激酶活性降低也介导了缺血模型的神经损伤[11]。烷化剂N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)处理皮层神经元和星形胶质细胞,可诱导PARP-1明显激活。此时细胞糖酵解速率明显下调,其原因是糖酵解过程中己糖激酶的活性受抑制,而不是辅酶NAD+水平下降所引起[11]。研究者发现己糖激酶-1和己糖激酶-2拥有PAR的结合基序,在PARP激活后,己糖激酶-1与PAR免疫共沉淀,使己糖激酶-1发生PARylation。且体外己糖激酶酶活性测定显示PAR可直接抑制己糖激酶。己糖激酶活性抑制的时间过程与PARP激活后观察到的糖酵解和线粒体功能的下降平行。当使用PARP-1抑制剂或给予多聚ADP核糖水解酶后,可逆转MNNG引起的己糖激酶活性下降和能量匮乏[11]。此外,己糖激酶与PAR结合后,可与线粒体外膜中的电压依赖性阴离子通道发生相互作用,导致己糖激酶与线粒体外膜解离从而失活,使进入线粒体的丙酮酸和还原当量减少,限制了线粒体氧化呼吸链底物的可用性[29]。因而,在细胞和动物水平的缺血模型中,直接给予丙酮酸等三羧酸循环的底物可减少神经元死亡[30,31]。这提示,PARP-1催化糖酵解过程的酶发生PARylation从而使细胞代谢受损是其介导神经损伤的重要因素之一。

4、多腺苷二磷酸核糖基化修饰通过介导细胞死亡促进神经退行性变性疾病的发生和发展

神经退行性变性疾病涉及多种细胞死亡形式。各种损伤因素导致核内PARP-1过度激活时,PARP-1自身及其他底物蛋白的PARylation水平增高后,PAR链可被多聚ADP核糖水解酶等切割并释放到细胞质中,PAR与线粒体中凋亡诱导因子结合,使凋亡诱导因子从线粒体释放,与巨噬细胞移动抑制因子结合进入细胞核后引起大规模的DNA片段化和染色质凝聚,导致细胞死亡[9,32]。这种由PARP-1介导的不依赖于半胱氨酸蛋白酶(caspases)的细胞死亡形式被命名为Parthanatos(thanatos:希腊神话中的死神)[9,32]。Parthanatos在神经退行性变性疾病中的作用研究已有二十多年,由谷氨酸兴奋性毒性、氧化应激和一氧化氮等引发,可能是损害神经元导致神经变性的主要途径[29]。

在脑缺血动物模型中,活性氧过度积累导致PAR大量生成可引起神经损伤。与野生型小鼠相比,PARP-1和PARP-2基因敲除小鼠的脑缺血梗死体积明显缩小[33]。在大鼠脑缺血模型上也证实有Parthanatos发生,而PARP-1抑制剂可以减少细胞死亡[34]。Iduna是一种PAR依赖的E3泛素连接酶,在与底物相互作用时调节细胞反应,如蛋白酶体降解和DNA修复。在新生大鼠脑缺血模型中,Iduna通过与凋亡诱导因子结合,促进凋亡诱导因子的降解而阻断其核移位,从而抑制Parthanatos发挥神经保护作用[35]。在阿尔茨海默病和帕金森病模型中也存在PARP-1的激活和随后的细胞死亡[36]。研究证实,用β-淀粉样蛋白处理大鼠脑片,可激活PARP-1,增加凋亡诱导因子从线粒体到细胞核的移位[36]。在来自帕金森病患者的原代神经元培养物和注射MPTP的小鼠黑质多巴胺能神经元中,PAR的表达明显增加且伴有凋亡诱导因子的核移位[36]。PARP-1抑制剂可减少黑质多巴胺能神经元中的凋亡诱导因子移位和细胞死亡,提示PARP-1过度激活引起的凋亡诱导因子移位可能是MPTP诱导神经炎症和细胞死亡的关键调节因素,而Parthanatos可能是多巴胺能神经元丢失的主要原因[36,37]。因此,PARP-1过度激活后催化其自身及其他底物蛋白发生PARylation,增加细胞内PAR水平从而导致Parthanatos,可能是帕金森病等神经退行性变性疾病中神经细胞死亡的主要方式。

此外,细胞凋亡也是神经退行性变性疾病中的另一种细胞死亡方式。在DNA损伤、氧化应激、缺血等刺激下,肿瘤抑制因子p53可以作为信号分子调节细胞存活和凋亡[36,37]。p53在散发性的阿尔茨海默病患者脑组织中、帕金森病患者黑质中、缺血再灌注大鼠海马中均被激活[29,38,39]。一旦被激活,p53蛋白大量表达并进行翻译后修饰,包括PARylation[40]。研究表明,p53蛋白和PARP-1的相互作用对维持基因组完整性至关重要[36]。在MPTP诱导的帕金森病模型中,PARylation修饰p53水平的增加,可使神经元易于死亡[23]。在β-淀粉样蛋白处理的阿尔茨海默病模型中,p53蛋白水平也明显增加,用PARP-1抑制剂预处理细胞能使p53蛋白水平恢复正常并减弱β-淀粉样蛋白的毒性作用[41]。因此,由PARylation介导的神经细胞死亡可能是神经退行性变性疾病发生和发展至关重要的一环。

5、结语

PARylation作为神经退行性变性疾病中一种重要的蛋白质翻译后修饰方式,不仅是神经退行性变性疾病进展的原因,也是极具潜力的药物干预靶点(图1)。PARP抑制剂通过抑制蛋白发生

图1多腺苷二磷酸核糖基化修饰(PARylation)在神经退行性变性疾病中的作用

PARylation,在急性和慢性神经损伤的实验模型中都展现了明显的神经保护作用,具有巨大的应用潜力。然而,PARP-1抑制剂目前主要用于抗肿瘤治疗,已有多种PARP-1抑制剂进入临床实验。2014—2017年,PARP-1抑制剂olaparib,rucaparib和niraparib这三种药物已被美国食品药品监督管理局批准用于治疗有或无乳腺癌易感基因突变的卵巢癌患者[42]。目前,部分新型PARP-1抑制剂已经进入神经退行性变性疾病治疗的临床试验。例如MP-124,一种很有前景的适用于急性缺血性脑卒中的神经保护剂,已处于临床试验Ⅰ期;在韩国,静脉注射JPI-289用于急性脑卒中治疗,已进入临床试验Ⅱ期。

PARylation在细胞内作用复杂,一方面,PARP-1能够介导DNA的损伤修复;另一方面,PARP过度激活引起PARylation和PAR过度增加可致细胞死亡和其他病理变化。因而,靶向PARP的药物是一把双刃剑,在治疗神经退行性变性疾病的同时也会产生一定不良反应[42]。在设计新型PARP抑制剂时,应先鉴定发生PARylation的蛋白,设计更具特异性的抑制剂,这可避免其他受PARylation调节的细胞途径被影响而产生不良反应;另外,还应考虑药物的药动学特点,如其水溶性、血脑屏障的通透性等[43]。但不管怎样,以蛋白PARylation为靶点的抑制剂可为神经退行性变性疾病的临床治疗带来新的希望。

王毅,卢韵碧.多腺苷二磷酸核糖基化修饰与神经退行性变性疾病[J].浙江大学学报(医学版),2020,49(01):100-106.

基金:浙江省自然科学基金(LY18H170001);浙江省医药卫生科技计划(2017KY320);浙江省教育厅一般科研项目(Y201636340)