现代研究发现，糖尿病是一种以高血糖为特征的内分泌代谢障碍性疾病，其患病率在逐年上升，严重危害人体健康[1]。2型糖尿病最主要的致病因素是胰岛素抵抗[2]。而自噬水平的过度激活可促进凋亡的发生，造成细胞不必要的损伤[3]，这可能是导致胰岛素抵抗的原因之一。2型糖尿病中引起β细胞数目减少的主要原因就是细胞凋亡[4]。近年来市面上现有的口服降糖药主要有双胍类、胰岛素增敏因子、α-葡萄糖苷酶抑制剂等，这些药物通过延缓和减少机体对葡萄糖的吸收、提高组织器官对胰岛素的敏感性等来治疗2型糖尿病[5]。目前并非所有患者均适用已有的降糖药，这些降糖药在临床治疗中存在一些局限性，故需要开发适用范围更广的降糖药物。

甲基莲心碱是从睡莲科植物莲的成熟种子绿色胚芽中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱，有着广泛的药理作用[6]。甲基莲心碱具有降低血糖的作用，并可用于治疗实验中建立的2型糖尿病大鼠模型。目前与甲基莲心碱相关降血糖的实验研究较少，在这些已有的研究中，其实验研究对象多为大鼠模型。本实验从新的方向进行研究，建立与以往实验不同的实验模型，以研究甲基莲心碱的降糖活性。

1、材料与方法

1.1实验细胞

人肝癌细胞株HepG2，购于美国模式菌种收集中心(ATCC)细胞库。

1.2实验药物

甲基莲心碱购自上海源叶生物科技有限公司[批号:b20598-20mg，纯度，高效液相色谱法(HPLC法)≥98%]。

1.3试剂和仪器

DMEM高糖培养基(美国HyClone公司);青霉素-链霉素混合液(北京博奥拓达科技有限公司);胎牛血清(美国O-RIGIN公司);磷酸盐缓冲液(北京博奥拓达科技有限公司);胰岛素(诺和灵R);胰蛋白酶-EDTA溶液(北京博奥拓达科技有限公司);葡萄糖检测试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司);cck-8(日本同仁化学研究所);细胞培养瓶(美国Fisherscientific公司);96孔板(美国Corning公司);BCA蛋白定量试剂盒(凯基生物科技有限公司);抗体mTOR、pmTOR、自噬微管相关蛋白轻链(LC3)、泛素结合蛋白(p-P62)、β-actin;Blockingone(日本NacalaiTesque公司);Solution1、Solution2(日本TOYOBO公司);10×TBST封闭洗涤缓冲溶液、10×TBS封闭洗涤缓冲溶液(北京普利莱基因技术有限公司);分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液(北京普利莱基因技术有限公司)。

R200D型分析天平(瑞士METTLER公司);AIRTECH超净台;IX71倒置显微镜(日本Olympus公司);SC3610型低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)。

1.4建立胰岛素抵抗模型

1.4.1培养HepG2细胞

HepG2细胞冻存于液氮储存系统中，使用时取出进行传代培养。将取出的HepG2细胞置于35℃的水浴中复苏。在超净台中将离心沉淀后的细胞装入含有DMEM高糖培养基、胎牛血清和青霉素-链霉素混合液的细胞培养皿中。混合后将细胞培养瓶放入孵育箱中培养，待细胞贴壁生长后取出培养瓶，用磷酸缓冲液(PBS)清洗细胞，加入适量的胰蛋白酶-EDTA溶液消化贴壁的细胞50s，用含血清的培养基使细胞停止消化。将处理好的细胞转移至离心管中在800r/min的转速下离心，离心结束后倒掉上部培养基加入新培养基，用移液器混匀使之成为均匀的细胞混悬液。将细胞混悬液分装入新的培养瓶中继续培养。

1.4.2HepG2细胞胰岛素抵抗模型的建立

将胰岛素母液稀释为10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L5个浓度。取96孔板，将HepG2细胞均匀接种于96孔板中，每列6个复孔作为一组，每组加入不同含浓度的胰岛素和正常组。依此操作做相同的6个实验模型，每个实验模型培养时间分别为12h、24h、36h、48h和60h。培养结束后用葡萄糖测试盒测定细胞的耗糖量。

1.4.3甲基莲心碱对HepG2细胞活性的影响

精密称取甲基莲心碱溶于二甲基亚砜(DMSO)中配成浓度为1mol/L的母液，取处于对数生长期的HepG2细胞，在显微镜下计数1×105个/ml细胞接种至96孔板，每孔加100μl细胞混悬液。培养24h，待细胞贴壁生长达到95%时，开始实验。实验分为正常组、实验组(甲基连心碱浓度分别为1000μmol/L、500μmol/L、250μmol/L、125μmol/L、62.5μmol/L、31.25μmol/L、15.625μmol/L、7.8125μmol/L)、对照组，24h后每孔加入含10%CCK-8的培养基100μl，避光培养1h后用酶标仪在波长为450nm下检测吸光度数据。细胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%,As为实验组吸光度值，Ab为对照组吸光度值，Ac为正常组吸光度值。

1.5甲基莲心碱对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗的影响

取对数生长期的HepG2细胞，倒掉培养基加磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，用胰蛋白酶消化，加培养基终止消化，离心处理弃去原培养基，加10ml新培养基后混匀成细胞混悬液。将细胞接种于96孔板中，6个复孔为一列，每个孔加100μl细胞混悬液后摇匀，培养24h。弃去原培养基，加入含筛选出的胰岛素浓度的培养基100μl，培养36h后得胰岛素抵抗细胞模型。给细胞模型加无血清培养基做饥饿处理，培养12h后加PBS清洗。实验分为正常组(正常细胞+培养基)、胰岛素抵抗组(胰岛素抵抗细胞+培养基)、实验组(80μmol/L、40μmol/L、20μmol/L、10μmol/L甲基莲心碱+培养基)、每组6个复孔，干预12h。葡萄糖消耗实验结束后，按照CCK-8试剂盒说明书操作，于酶标仪中450nm波长下检测各组OD值。

1.6甲基莲心碱对HepG2细胞PI3K/AKT通路中相关蛋白表达的影响

培养HepG2细胞使之处于对数生长期，将对数生长期的细胞以8×105/ml的密度接种到6孔板中，每孔2ml，正常组、胰岛素抵抗组、药物干预组(80μmol/L、20μmol/L)，每组各3个复孔，给药12小时后，PBS清洗细胞后加裂解液用细胞刮刀收集细胞提取总蛋白，之后用蛋白定量试剂盒测定在酶标仪下测定蛋白浓度，将每组蛋白调整为统一值，100℃煮沸5min放置室温后于-20℃冰箱保存备用。

电泳:将制好胶的玻璃板安装到电泳槽里，每组样品以10μg上样量加入孔中，100V电泳1.0～1.5h，聚偏氟乙烯(PVDF)膜用甲醇活化30s后放入转膜液中浸泡30min以上，采用湿法转膜，转膜后用1×TBS在室温清洗膜10min;封闭液室温下封闭膜20min。一抗mTOR、p-mTOR、LC3、p-P62、β-actin用稀释液1︰800稀释后4℃孵育膜12h,1×TBST洗膜后加1︰2000稀释的羊抗兔二抗，室温孵育1h后用1×TBST、1×TBS清洗膜，加适量发光液，避光反应1～2min，将膜放入成像仪器中成像。

样品从4℃冰箱拿出后放于室温中使其融化，涡旋1min保证样品蛋白浓度一致，用微量加样器贴壁吸取样品，缓慢加入孔中，第一个孔加入3μl标记物(Marker)，其余每孔加入样品12～20μg，上样时间尽量短，避免样品扩散。每加一个样品更换一个微量加样器，以免交叉污染。记录好加样顺序，上样完毕，盖好电泳槽的盖子，注意正负极，选择合适的电压进行电泳，上层浓缩胶的电泳电压(90V)低于分离胶(100V)的电泳电压，以达到更好的浓缩效果。电泳时间约为1.5h，观察导燃料移位至凝胶下端即要停止电泳。

1.7统计学处理

数据处理采用SAS8.2统计学软件进行分析。两组间比较采用t检验;P<0.05表示有统计学差异。

2、结果

2.1IR模型

当胰岛素浓度为10-7mol/L，细胞培养时间为36h时，该细胞组的耗糖量最少，其胰岛素浓度为本次实验中最佳胰岛素抵抗浓度。见图1。

图110-7mol/L胰岛素不同培养时间的细胞耗糖量

2.2甲基莲心碱对HepG2细胞活性的影响

与正常组相比高浓度的甲级莲心碱能够显著抑制细胞活性，根据细胞存活率公式计算得到细胞存活率，然后各组均取对数可知细胞半抑制浓度(IC50)的甲基莲心碱浓度为88.02μmol/L。故最终作用于细胞的浓度设为80μmol/L、40μmol/L、20μmol/L、10μmol/L。见表1。

表1不同浓度甲基莲心碱作用下HepG2细胞存活率

2.3甲基莲心碱对HepG2细胞葡萄糖消耗的影响

模型组与正常组相比萄萄糖消耗量显著降低(P<0.01)，除10μmol/L甲基莲心碱外各浓度药物实验组葡萄糖消耗量均高于模型组(P<0.05)，分别可使细胞消耗葡萄糖增加23.2%、21.8%、18.6%、13.7%，各浓度实验组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2不同浓度甲基莲心碱作用下HepG2细胞葡萄糖消耗量

2.4甲基莲心碱对HepG2细胞mTOR、p-mTOR、LC3、P62蛋白表达的影响

与正常组相比，模型组mTOR、p-mTOR、LC3蛋白表达显著升高(t=2.446～4.007,P<0.05),P62蛋白表达量显著降低(t=3.848,P<0.05);与模型组比较，实验组mTOR、pmTOR、LC3蛋白表达量显著降低(t=2.149～2.972,P<0.05),P62蛋白表达量显著升高(t=3.851,4.884,P<0.05);甲基莲心碱高、低剂量组之间各蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、表3。

图2免疫印迹检测HepG2细胞mTOR、p-mTOR、LC3、P62蛋白表达

表3各组HepG2细胞mTOR、p-mTOR、LC3、p-P62蛋白表达的比较(x±s)

3、讨论

已有研究发现甲基莲心碱具有降糖活性，可提高胰岛素抵抗大鼠的胰岛素敏感性[7]，增加模型组的耗糖量。潘扬等[8]的实验中研究了甲基莲心碱对实验性糖尿病和肥胖大鼠模型的影响，结果显示给药甲基莲心碱后甲基莲心碱组空腹血糖显著低于模型组，且与二甲双胍组相近，甲基莲心碱组总胆固醇和甘油三酯皆显著低于模型组。这表明甲基莲心碱可使实验中肥胖及糖尿病大鼠的血脂和血糖降低。刘双梅等[9]的实验中，探究了甲基莲心碱对2型糖尿病模型大鼠的代谢物变化的影响，实验结果表明甲基莲心碱组处理后的大鼠空腹血糖比糖尿病组模型大鼠低，且甲基莲心碱组大鼠的空腹血胰岛素、总胆固醇和甘油三酯均有降低。以上实验表明甲基莲心碱可降低糖尿病大鼠的血糖，改善2型糖尿病大鼠的糖尿病症状，并可使其尿液代谢产物减少。葛敏等[10]的实验研究中测定甲基莲心碱对高血压大鼠胰岛素抵抗模型糖耐量的影响，实验结果表明给药甲基莲心碱后高血压大鼠的血糖降低，说明甲基莲心碱可改善肾性高血压大鼠的糖耐量，降低胰岛素抵抗大鼠的血糖值。

目前的实验研究中关于甲基莲心碱的降糖实验通常以动物作为实验模型，但这在饲养和实验处理时操作较为麻烦。为此研究员们开发了几种便于药理等实验研究的以肝细胞为基础的细胞模型，HepG2细胞便是其一[11]。本实验采用的是取自人体肝癌细胞株的HepG2细胞作为实验模型，而肝脏是人体主要的代谢器官，也是胰岛素作用的靶器官，所以HepG2细胞具备很多肝脏特异性相关功能，表面又具有高亲和力的胰岛素受体，满足胰岛素受体所要求的条件[12]。李长贵等[13]的实验中选用HepG2细胞作为实验模型来探究胰岛素抵抗的建立条件，该实验将HepG2细胞放入不同浓度的胰岛素中培养24h，该结果显示当胰岛素浓度为10-7mol/L时，细胞表面的胰岛素受体减少得最明显，且可维持该状态长达48h。通过建立胰岛素抵抗细胞模型和测定细胞的耗糖量等方面来研究甲基莲心碱的降糖作用，这使得甲基莲心碱的开发具有广泛的临床意义。

mTOR，是一类分子量为289KD的大分子蛋白质，研究表明，PI3K/Akt通路和LKB1/AMPK通路都可以调控mTOR[14]。当营养过剩或血糖持续升高时，胰岛素信号通路PI3K/Akt持续激活mTOR/S6K1，引起IRS1抑制性丝氨酸磷酸化水平的增加，减弱胰岛素受体与胰岛素的反应性，形成胰岛素抵抗，mTOR负反馈影响胰岛素受体的表达[15]。LC3包括LC3-1、LC3-2两种可相互转化的形式，参与自噬膜的形成，细胞内新生成的LC3经过加工，形成胞浆可溶性的LC3-1，经泛素化加工修饰，与自噬膜表面的磷脂酰丝氨酸结合，成为膜结合形式的LC3-2，定位于前自噬体和自噬体[16]，一般以LC3-2/LC3-1的比值反映自噬的强度[17]。而P62是自噬溶酶体降解蛋白，自噬越强，其含量越少。实验结果可知，胰岛素抵抗的HepG2细胞中p-mTOR、LC3表达显著增加而P62的表达则减少说明自噬可能是胰岛素抵抗的原因之一，甲基莲心碱给药后细胞自噬减弱。

4、结论

高浓度的甲基莲心碱抑制HepG2细胞存活率，筛选出合适浓度的甲基莲心碱后发现其对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗量有一定的促进作用，对细胞自噬也有显著影响，可通过减少细胞自噬来改善胰岛素抵抗作用。但是本研究仅仅考虑了一种体外细胞模型，具有局限性，且甲基莲心碱是否通过其他作用机制来改善胰岛素抵抗以及这些作用机制之间的联系还需进一步的研究。

参考文献：

[1]李金磊.黄芪散改善二型糖尿病胰岛素抵抗模型小鼠糖脂代谢及其机制研究[D].广州:广州中医药大学,2014.

[2]吕艳萍.2型糖尿病发病危险因素及护理干预[J].转化医学电子杂志,2015,2(11):157-158.

[4]杨庆宇,郜娜.利拉鲁肽通过调节microRNA-375对胰岛细胞凋亡的影响[J].中国病理生理杂志,2016,32(9):1627-1634.

[5]陈璇.白虎二地汤调控胰岛素信号通路改善2型糖尿病胰岛素抵抗的研究[D].南京:南京中医药大学,2015.

[6]任美.莲芯粉中甲基莲心碱的酶法提取及抗氧化研究[D].长沙:湖南农业大学,2016.

[8]潘扬,尚文斌,王天山,等.莲子心及Nef对实验性糖尿病及肥胖大鼠模型的影响[J].南京中医药大学学报,2003,19(4):217-219.

[9]刘双梅,李桂林,汤晓丽,等.甲基莲心碱对2型糖尿病模型大鼠作用的代谢组学研究[J].中国药理学通报,2012,28(4):490-495.

[10]葛敏,饶曼人,潘扬.甲基莲心碱与牛磺酸对高血压大鼠血压及糖耐量的影响[J].中国药学杂志,1995,30(12):721-724.

[11]马军国.微囊藻毒素对HepG2细胞的毒性及其作用机制研究[D].郑州:河南师范大学,2016.

[12]刘亚萍,李雨蒙,王梦,等.菊粉复配灵芝多糖对HepG2细胞胰岛素抵抗的调节作用[J].中国食品添加剂,2018(12):116-121.

[13]张敬升,黄伟,谢鸣.小檗碱对体外HepG2细胞IR模型抗IR的效应及机制[J].中国实验方剂学杂志,2018,24(21):138-143.

[15]张鑫愉,周晓勐,牛燕媚,等.mTOR复合物在有氧运动改善小鼠骨骼肌糖代谢过程中的作用[J].中国运动医学杂志,2018,37(12):1017-1023.

[16]王静,王瑾,王娟娟,等.自噬在TXNIP过表达诱导的INS-1胰岛细胞凋亡中的作用[J].生理学报,2017,69(4):445-451.

魏萍,薛春苗,潘霖,雷珍珍,曹俊岭.甲基莲心碱对胰岛素抵抗的HepG2细胞降糖的影响[J].临床和实验医学杂志,2020,19(12):1283-1286.