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黄芪甲苷对高糖状态下人脐静脉内皮细胞的增殖作用及机制

2020-07-20 324 上传者：管理员

摘要：目的：探讨黄芪甲苷对高糖状态下人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖作用及机制。方法：建立HUVEC高糖模型。将HUVEC随机分为9组:第1模型组至第6模型组(分别用5.5,10.0,15.0,20.0,25.0和30.0mmol•L-1葡萄糖处理)、实验组(在第6模型组的基础上,加入黄芪甲苷400mg•L-1处理)以及第1转染组至第2转染组(分别用对照腺病毒和KLF5腺病毒来转染HUVEC)。用噻唑蓝法和转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记技术检测细胞活力(OD值)和凋亡率;实时定量PCR技术检测增殖细胞核抗原(PCNA)和己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)和丙酮酸激酶(PKM)基因的相对表达量。结果：第1模型组、第6模型组和实验组的细胞活力分别为0.88±0.12,0.38±0.07和0.68±0.06;这3组的PCNA基因的相对表达量分别为1.00±0.0,0.43±0.09和0.88±0.08,第6模型组与第1模型组相比、或实验组与第6模型组相比,差异均有统计学意义(均P<0.05)。第6模型组和实验组的细胞凋亡率分别为(25.64±2.42)%和(10.54±1.12)%,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。第1转染组和第2转染组的细胞活力分别为0.80±0.11和1.03±0.09;这2组的PCNA基因的相对表达量分别为1.00±0.00,1.75±0.16;这2组的HK基因相对表达量分别为1.00±0.00,1.86±0.14;这2组的PFK基因相对表达量分别为1.00±0.00,1.85±0.12;这2组的PKM基因相对表达量分别为1.00±0.00,1.93±0.17。上述指标:第2转染组与第1转染组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论：黄芪甲苷对高糖状态下内皮细胞功能的改善作用是通过促进细胞糖酵解实现的。

关键词：
内皮细胞
糖酵解
细胞凋亡
高糖
黄芪甲苷
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糖尿病导致的内皮细胞功能紊乱可导致多种心血管疾病的发生[1]。黄芪甲苷可抑制炎症反应、降低血糖和防衰老,对糖尿病的多种并发症具有明显的保护作用[2]。Kruppel类因子5(KLF5)对心血管等多种疾病的发生和发展起重要的作用[3]。本实验探讨了黄芪甲苷对高糖诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用和相关机制。

材料与方法

1材料

细胞人脐静脉内皮细胞(HUVEC),由河北医科大学生物化学与分子生物学研究室提供。

药品与试剂黄芪甲苷,规格:每袋1g,批号:84687-43-4,南京春秋生物工程有限公司生产;D-葡萄糖,规格:每支250g,批号:G7528,购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。噻唑蓝(MTT),购自碧云天生物科技有限公司;转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记细胞凋亡检测试剂盒,购自碧天生物科技有限公司。

仪器酶标仪,美国Thermo公司产品;荧光显微镜,德国Leica公司产品;实时定量-PCR仪,美国BioRad公司产品。

2实验方法

2.1分组与处置

HUVEC随机分为9组:第1模型组至第6模型组、实验组以及第1转染组至第2转染组。

第1模型组至第6模型组的HUVEC分别用5.5,10.0,15.0,20.0,25.0和30.0mmol·L-1葡萄糖处理;实验组:在第6模型组的基础上,加入黄芪甲苷400mg·L-1处理;第1转染组和第2转染组:分别用对照腺病毒和KLF5腺病毒来转染HUVEC。

2.2细胞培养、腺病毒感染[3]3]和黄芪甲苷浓度配制[4]4]

将HUVEC传代,培养基为5%FBS内皮细胞培养基(葡萄糖5.5mmol·L-1)。

HUVEC生长至80%～90%时,在培养基中加入Ad-KLF5(50pfu·mL-1)或空病毒载体24h后,进行后续实验。

用DMSO溶解黄芪甲苷使其浓度为400mg·L-1,使用前用完全培养基调节其浓度至40μg·mL-1。

2.3HUVEC高糖模型的制备

参照文献[5]方法操作,HUVEC血清以2%FBS饥饿24h后,加入D-葡萄糖,调整葡萄糖浓度,处理5d,建立6个不同浓度的HUVEC高糖模型。

2.4用MTT方法检测几组的细胞活力[6]6]

细胞处理后,加入MTT溶液10μL,继续于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养4h。每孔加入DMSO溶液100μL,震动10min后,于酶标仪490nm波长处检测每孔光密度(OD)值,每组设3个复孔。

2.5用实时定量PCR法检测几组细胞中基因表达

收集处理好的细胞,PBS润洗后,加入Trizol处理液,按照RNA提取试剂盒说明书提取RNA。参照文献[3]方法操作,反转录为cDNA。取cDNA,在RealtimePCR反应体系中加入引物和SYBRmix。反应条件:95℃,30s;95℃,5s;60℃,30s,循环39次。每组设3个复孔。引物由金维智(北京)生物科技有限公司设计并合成。

2.6用TMDTBNEL法检测几组细胞的凋亡[6]6]

按照细胞凋亡试剂盒说明书进行操作。细胞接种后,以4%多聚甲醛固定,加标记缓冲液20μL,封闭液封闭后,加入生物素化抗地高辛抗体37℃孵育30min。Tris-HCl-Tween缓冲盐溶液清洗后,加入链霉亲和素-生物素复合物-异硫氰酸荧光素酯,37℃孵育30min后,封片。每组取3个视野,计算凋亡率。

3统计学处理[6]6]

实验数据经SPSS21.0软件分析,计量资料以x±s表示,2组比较用独立样本t检验。

结果

1高糖对HUVEC细胞活力的影响

第4模型组至第6模型组与第1模型组相比,细胞活力和PCNA基因相对表达量均明显降低,且与葡萄糖浓度呈负相关,差异均有统计学意义(均P<0.05),见表1。根据表1结果,选择第6模型组进行后续实验。

表1葡萄糖对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)活力(OD值)和增殖细胞核抗原(PCNA)基因表达的影响

2黄芪甲苷对高糖状态下HUVEC细胞活力的影响

第6模型组与第1模型组相比,细胞活力明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);实验组与第6模型组相比,细胞中PCNA基因表达水平明显增高,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2黄芪甲苷对HUVEC活力(OD值)和PCNA基因表达的影响(x±s)

3黄芪甲苷对高糖状态下HUVEC细胞凋亡的影响

实验组与第6模型组相比,细胞凋亡明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3黄芪甲苷对HUVEC凋亡的影响(x±s)

4KLF5对2个转染组HUVEC表达的影响

第2转染组与第1转染组相比,细胞活力和PCNA基因相对表达均明显升高,细胞凋亡明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.05),见表4。

表4KLF5对HUVEC活力(OD值)、PCNA基因表达和细胞凋亡的影响(x±s)

5黄芪甲苷对HUVEC细胞中糖酵解关键酶表达的影响

第2转染组与第1转染组相比,糖酵解途径中关键酶(HK、PFK和PKM)的基因相对表达量明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);第6模型组与第1模型组相比,HK、PFK和PKM的基因相对表达水平均明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);实验组与第6模型组相比,HK、PFK和PKM的基因相对表达水平均明显增加,差异均有统计学意义(均P<0.05),见表5。

表5黄芪甲苷对HUVEC中己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)和丙酮酸激酶(PKM)基因相对表达的影响

讨论

血管内皮细胞功能失调是糖尿病血管病变最早期的表现[7]。黄芪甲苷联用阿魏酸,通过调节JAK-STAT信号通路,促进血管内皮细胞增殖能力[8]。KLF5广泛参与细胞增殖、周期、迁移和凋亡等多种细胞生物学过程。在AngII作用下,KLF5可促进血管平滑肌细胞的增殖能力[9]。

本研究结果发现,高糖抑制HUVEC活力,在高糖处理的HUVEC中,加入黄芪甲苷可改善由于高糖导致的内皮细胞增殖能力的降低;黄芪甲苷处理的内皮细胞中,KLF5的表达明显升高。细胞的糖酵解途径是细胞有氧氧化的关键步骤。本实验中,在高糖基础上过表达KLF5可显著提高糖酵解过程中关键酶(HK、PFK和PKM)在HUVEC中的表达。

本研究结果表明,黄芪甲苷可逆转由高糖导致的血管内皮细胞增殖能力的降低,黄芪甲苷可促进高糖状态下KLF5的表达,过表达KLF5可促进细胞糖酵解,从而实现对细胞增殖的促进作用。

参考文献：

[4]王少华.高糖诱导的lncRNAMIR181A2HG在调节血管内皮细胞增殖和迁移中的作用及相关机制[D].河北石家庄:河北医科大学,2018.

[8]李玉梅,鲍慧玮,王楚盈,等.黄芪甲苷与阿魏酸合用调控JAK-STAT通路促进血管内皮细胞增殖作用的研究[J].中国比较医学杂志,2019,29(1):1-8.

刘春茹,赵静,王泽宇,史文新,刘姣,王少华.黄芪甲苷对高糖状态下血管内皮细胞增殖的影响[J].中国临床药理学杂志,2020,36(12):1661-1664.

基金:河北省科学技术厅计划基金资助项目(162777194);河北省中医药管理局计划基金资助项目(2018114).