创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury,TBI)是常见的脑外科疾病,由于直接或间接暴力作用于头部,损伤脑实质,引起暂时或永久性的意识丧失、记忆缺失、认知及神经功能障碍等,致残率和死亡率极高[1,2]。根据病理性质可将TBI分为原发性和继发性[3],由于直接冲击造成的原发性颅脑损伤难以逆转,但是继发的一系列神经炎性反应及神经功能缺失所引起的偏瘫、智力减退等通过治疗可以得到缓解。

临床上电针治疗TBI疗效确切[4],但在发生TBI后何时介入电针治疗效果最佳及其具体治疗机制尚不明确。课题组前期研究[5,6]发现电针早期干预可调控凋亡信号,延缓TBI大鼠脑神经元坏死,但电针治疗TBI是否与调控自噬相关,尚缺乏系统的研究。AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是广泛存在于细胞中的一条重要信号通路,在细胞代谢和应激中起关键作用,通过影响其下游多种效应分子的活化状态,促进细胞生长、调控自噬、抑制凋亡[7]。本研究拟初步明确电针对TBI的早期治疗效应,从自噬的角度,观察电针对TBI大鼠AMPK/mTOR通路自噬相关蛋白的调节作用,探讨电针促进TBI康复的作用机制。

1、材料与方法

1.1实验动物与分组

SPF级健康6周龄雄性SD大鼠40只,体质量(200±20)g,购自成都达硕实验动物有限公司,生产许可证号:SCXK(川)2015-030,饲养于陕西中医药大学科研实验中心,环境温度(25±2)℃,湿度(54±2)%,分笼饲养,明暗周期12 h,大鼠自由摄食和饮水。适应性饲养7 d后将大鼠随机分为假手术组、模型组、电针Ⅰ组、电针Ⅱ组,10只/组。实验过程中对动物的处置符合2006年科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》中相关动物伦理学规定。

1.2主要仪器与试剂

CR22G高速冷冻离心机(日本日立),KD-2268轮转式切片机、数码显微镜及图像采集分析系统(德国卡尔蔡司),SpectraMax5酶标仪(美国Molecular Devices),Image-Pro Plus 6.0图像分析软件(美国Media Cybernetics),JY600电泳仪及蛋白转印系统(北京君意东方电泳设备有限公司),G6805-2A型电针治疗仪(上海华谊公司)。AMPK抗体、磷酸化(p)-AMPK抗体、mTOR抗体、p-mTOR抗体、Ulk1抗体、p-Ulk1抗体(美国Santa Cruz),HRP标记的羊抗小鼠IgG(上海碧云天生物技术有限公司),BSA牛血清白蛋白(美国Sigma),尼氏染色液(北京索莱宝科技有限公司)。

1.3 TBI模型制备

2%戊巴比妥钠(0.2 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠,参照Feeney[8]的自由落体方法加以改良制备大鼠左侧TBI模型。固定大鼠于脑立体定位仪,沿正中线左侧旁开5 mm处开一长约1.5 cm的纵向切口,用电磨机于冠状缝后6 mm、矢状缝左侧旁开4 mm处钻出一直径5 mm的小孔,用20 g砝码由35 cm高度的透明玻璃管中垂直下落打击小孔,造成左脑顶叶中度损伤。缝合皮肤后单笼饲养。假手术组仅钻开头骨,无打击。术后连续7 d腹腔注射庆大霉素(0.5 mg/100 g)注射液抗感染治疗。

1.4干预方法

根据华兴邦等[9]制定的大鼠穴位图谱中大鼠穴位的取穴标准,用一次性无菌针灸针(0.30 mm×25 mm)针刺“水沟”(直刺1 mm)、“百会”(向前斜刺2 mm)、患侧“内关”(直刺1 mm)、 患侧“足三里”(直刺7 mm)。“水沟”点刺20 s后出针,“百会”留针10 min,“内关”“足三里”穴接电针仪,强度以动物肢体轻微抖动为宜,约1 mA,断续波,频率2 Hz,留针10 min,1次/d。于建模后第7天开始对电针Ⅰ组大鼠进行电针干预,连续7 d;于建模后24 h开始对电针Ⅱ组大鼠行电针干预,连续14 d。假手术组与模型组每次以同样的方法抓取固定大鼠10 min,1次/d,共14 d。

1.5观察指标与检测方法

于造模后第15天用2%戊巴比妥钠(0.2 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠后,剪开胸腹,暴露心脏,用预冷0.9%氯化钠溶液灌注后取出脑组织(冰上操作),迅速剥离损伤部位皮层,分为2部分。用于病理切片染色的组织在4%多聚甲醛中固定24 h后常规脱水、石蜡包埋及切片(3μm);用于做蛋白检测的组织迅速存于-80℃冰箱备用。

HE染色观察大鼠损伤区脑组织形态结构的变化:将上述石蜡切片进行脱蜡、水化后浸入苏木素染色液5 min;纯水冲洗后浸入伊红染色液1 min,纯水冲洗;镜下观察着色情况,必要时加入分化液分化1～2 s,最后用中性树胶封片,光学显微镜下观察大鼠脑组织形态结构变化。

尼氏染色观察大鼠损伤区脑组织神经元变化:将切片脱蜡及水化(同前);浸入焦油紫染色液置于56℃温箱1 h;浸入分化液4～20 s后,脱水、中性树胶封片,避光保存,拍照观察。

Western blot法检测相关蛋白表达:从-80℃冰箱取出组织,加入RIPA裂解液(含PMSF)抽提蛋白,用BCA法测量样品蛋白浓度,金属浴10 min,按说明书制胶及电泳,转膜,封闭,加入一抗AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、Ulk1、p-Ulk1(稀释比例均为1︰600),4℃孵育过夜;加入羊抗小鼠二抗(1∶1 000)37℃孵育1 h,ECL法发光显影;Image J分析各条带的灰度值,以β-actin为内参蛋白,以目的蛋白与内参蛋白的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.6统计学处理

用SPSS19.0统计软件进行数据分析,用Graphpad prism5.0软件整理生成统计图。计量资料用均数±标准差(x−±s)表示。采用单因素方差分析评价整体差异性,组间比较选用LSD检验。以P≤0.05为差异有统计学意义的标准。

2、结果

2.1各组大鼠损伤区脑组织皮层病理形态的比较

HE染色显示,假手术组神经元分布均匀、排列整齐、形态结构正常,胞核多为圆形蓝染,胞质为粉红淡染,无坏死、渗出。模型组可见细胞核固缩、破碎等,空泡明显,出现坏死区域,可见瘢痕组织。电针Ⅰ组、电针Ⅱ组受损脑组织空泡样改变与瘢痕较模型组明显减少,电针Ⅱ组恢复情况优于电针Ⅰ组。见图1。

尼氏染色显示,假手术组的尼氏小体分布均匀,呈斑片、虎斑或颗粒状。模型组损伤区尼氏小体的数量明显减少。电针Ⅰ组、电针Ⅱ组尼氏小体缺失数量均较模型组减少。见图2。

图1各组大鼠损伤区脑组织皮层HE染色比较

图2各组大鼠损伤区脑组织皮层尼氏染色比较

2.2各组大鼠损伤区脑组织皮层中AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、Ulk1、p-Ulk1蛋白表达的比较

与假手术组比较,模型组大鼠损伤区脑组织皮层中p-AMPK/AMPK显著升高(P<0.01),p-mTOR/mTOR、p-Ulk1/Ulk1均显著降低(P<0.01)。与模型组比较,两电针组p-AMPK/AMPK显著降低(P<0.01),p-mTOR/mTOR、p-Ulk1/Ulk1显著升高(P<0.01)。与电针Ⅰ组比较,电针Ⅱ组p-AMPK/AMPK明显降低(P<0.05),p-mTOR/mTOR、p-Ulk1/Ulk1明显升高(P<0.05)。见图3。

图3各组大鼠损伤区脑组织皮层中p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、p-Ulk1/Ulk1比较

3、讨论

电针在治疗TBI等神经系统疾病方面效果较好[10,11,12,13]10-13],并引起医学界的广泛关注。相关研究[11,14]11,14]表明“足三里”“百会”“内关”“水沟”是治疗TBI的优选腧穴。百会位居巅顶,属督脉,有“三阳五会”之称,可醒脑安神、振奋阳气、升清化浊。水沟亦属督脉,为醒脑苏厥之要穴。内关属八脉交会穴,亦是手厥阴心包经之络穴,“络心系”,故可调神定志。足三里为足阳明胃经之合穴,可“疗五劳羸瘦,七伤虚乏”,又有“治痿独取阳明”之说,可濡润宗筋,乃强壮人体之必取穴。诸穴合用,可醒脑开窍、调和阴阳、通经活络、补益气血,促进TBI的康复。

Shi等[15]15]研究报道电针可明显改善大脑损伤区域内的血流量和脑细胞的摄氧能力,提高氧代谢,促进少突胶质前体细胞的增殖与分化,帮助髓鞘重建,提高神经组织的修复能力。但电针治疗TBI的具体分子机制目前还未完全清楚。

自噬与凋亡是颅脑损伤后神经元的重要生理病理变化基础[16,17]16-17],由于刺激的程度和刺激时间的不同,凋亡和自噬的强弱有所差别,如在脑缺血早期阶段,细胞自噬被迅速激活,并抑制细胞凋亡的发生,凋亡和自噬以相互排斥的形式发展。但随着缺血时间的延长,自噬被过度激活,导致细胞受损,进而引发细胞凋亡,并最终通过凋亡依赖途径诱导细胞死亡[18]18]。相关研究[19]19]显示:在炎性反应、氧化应激等病理情况下,自噬过度激活会加重细胞的损害,诱导细胞发生自噬性细胞死亡。在神经系统中,自噬参与降解细胞内的异常蛋白质,有利于防止神经元内异常蛋白的蓄积。与此同时,活跃的自噬作用会过度降解胞质内的细胞器,导致神经元功能缺失,并引发神经退行性疾病[20]20]。

AMPK/mTOR信号通路在调控自噬中起着枢纽的作用[21]21],其中AMPK、mTOR与Ulk1的活化在调控自噬对颅脑损伤等疾病的防治中起着重要作用。活化的AMPK可通过磷酸化结节性硬化复合体(TSC2)激活TSC1/2,进而抑制小GTP酶Rheb,负向调控mTOR功能,抑制mTOR磷酸化,促进自噬的发生[22]22]。此外,AMPK也可以通过磷酸化联接蛋白raptor,阻碍raptor与mTOR或mTOR与底物的结合,同样抑制mTOR的活化[23]23]。Yang等[24]24]研究亦显示,TBI时p-AMPK通过抑制mTOR的活性,诱导自噬的发生并促使细胞凋亡,加剧TBI。越来越多的研究[25,26]25-26]证实,当细胞处于异常状态时,活化的AMPK能够抑制mTOR的活性,导致mTOR与Ulk1 Ser757位点的复合体解离,从而使Ulk1激活,促进自噬的发生,同时Ulk1也可被AMPK通过Ser317和Ser777的磷酸化直接激活,进而激活自噬[26]26]。

本研究显示,与假手术组比较,模型组p-AMPK蛋白表达水平上调,p-mTOR的表达下调,表明颅脑外伤后AMPK被激活,自噬活性增强,且AMPK与mTOR在自噬的调节中相互协调制约[21]21]。其中p-Ulk1的表达趋势与p-mTOR相似,表明TBI发生后p-AMPK抑制了mTOR的活化,同时也抑制了mTOR与Ulk1的相互作用,促进了自噬的发生。电针干预能够显著下调p-AMPK相对表达水平,上调p-mTOR、p-Ulk1相对表达水平,提示电针可能是通过抑制AMPK的磷酸化,促进mTOR与Ulk1的活化,进而抑制神经元发生过度的自噬,从而发挥脑保护作用。临床上多是在TBI病情趋于稳定后才开始介入电针治疗,缺乏TBI急性期采用电针干预的相关研究。本研究显示,与模型组比较,电针Ⅰ组、电针Ⅱ组大鼠脑组织损伤情况改善明显,表明电针能够减轻神经元损伤程度,保护神经组织。其中电针Ⅱ组大鼠脑组织损伤改善情况明显优于电针Ⅰ组,此结果与课题组前期研究结果[5]5]一致,同时与电针Ⅰ组相比,电针Ⅱ组脑组织中p-AMPK/AMPK明显降低,而p-mTOR/ mTOR、p-Ulk1/Ulk1均升高,表明电针早期介入治疗对神经元自噬的调控作用更明显。

综上所述,电针可能是通过调节AMPK,mTOR和Ulk1等自噬相关蛋白的活化状态来抑制脑神经元自噬的过度活化,从而发挥对TBI的神经保护作用。由于此次实验缺乏抑制剂/阻断剂的使用,对其相关信号通路及具体的发生机制尚未明确,下一步的研究将阻断AMPK/mTOR信号通路,更深入探讨电针治疗促进TBI康复的机制,为临床应用和推广针灸治疗TBI提供科学的实验依据。

参考文献：

[4]彭璠,陈泽奇,罗杰坤.持续电针为主促醒重型颅脑外伤昏迷患者疗效观察[J].中国针灸,2010,30(6):465-468.

[5]吴涛,陈靖轩,安鹏飞,等.电针对颅脑损伤大鼠脑组织中AQP-4表达的影响[J].辽宁中医杂志,2017,44(6):1311-1315.

[6]吴涛.电针基于PI3K/AKT信号通路调控颅脑损伤大鼠脑神经细胞凋亡及水肿机制研究[D].成都:成都中医药大学,2015.

[9]华兴邦,周浩良.大鼠穴位图谱的研制[J].实验动物与动物实验,1991,1(1):1-5.

[10]李佳诺,孙忠人,尹洪娜,等.针刺对颅脑损伤后相关因素影响的动物实验研究进展[J].针灸临床杂志,2017,33(6):74-77.

[12]张毅敏,陈爱连,唐纯志,等.电针对重型颅脑损伤昏迷患者促醒作用的临床观察[J].针刺研究,2013,38(2):158-162.

[13]郭子泉,黄泳,姜华,等.早期针刺治疗颅脑创伤后肢瘫痪的疗效及作用机制研究[J].针刺研究,2019,44(8):589-593.

[14]林淑君,张玉娟,林吉欢,等.针刺对创伤性脑损伤大鼠神经损伤的影响[J].针刺研究,2019,44(1):23-28.

[17]刘昊,张菶,李新伟,等.针刺对出血性中风大鼠脑组织自噬相关蛋白表达的影响[J].针刺研究,2019,44(9):637-642.

谷婷,吴涛,王瑞辉,杨欢,柯增辉,王东,陈星,杨挺,孟晓鹏.电针对创伤性颅脑损伤大鼠损伤区皮层自噬相关蛋白表达的影响[J].针刺研究,2020,45(07):524-528+547.

基金:国家自然科学基金项目(No.81674088､81904310);陕西省中医药管理局课题(No.2019-zz-JC023);陕西省自然科学基金青年项目(No.2018JQ8070);陕西省教育厅专项科学研究计划(No.19JK0239);陕西省高校科协青年人才托举计划(No.20180308)