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血小板聚集功能受蛋白激酶A活化影响分析

2020-07-23 396 上传者：管理员

摘要：目的:研究蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)对体外血小板聚集功能的影响。方法:收集健康成年人外周血并获取洗涤血小板;采用PKA活化剂Forskolin体外处理洗涤血小板;利用瑞斯托霉素(Ristocetin),凝血酶(Thrombin),胶原(Collagen),二磷酸腺苷(ADP)诱导血小板聚集,利用血小板聚集仪检测血小板聚集情况。结果:与对照组相比较,5μmol/L的Forskolin可显著抑制ADP和Collagen诱导的血小板聚集(P<0.001);对Thrombin诱导的血小板聚集也具有一定抑制作用(P<0.05)。而2.5-10μmol/L的Forskolin对Ristocetin诱导的血小板聚集无明显抑制作用(P>0.05);对ADP和Collagen诱导的血小板聚集也具有显著抑制作用(P<0.001)。结论:蛋白激酶A活化能抑制血小板的聚集功能。

关键词：
生理性止血
病理性凝血
蛋白激酶A
血小板聚集
诱导剂
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血小板主要参与生理性止血与病理性凝血过程。近年来研究发现，血小板在多种疾病如动脉粥样硬化、免疫、炎症、肿瘤等发生发展过程中也发挥重要的作用[1,2]。血小板的活化过程受到多种因素的影响，涉及受体配体结合及复杂的信号通路[3]。因此深入了解血小板的功能，研究其功能调控机制，对疾病的预防及治疗具有重要的现实意义。

蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA）是1种丝氨酸苏氨酸依赖性蛋白磷酸化激酶，参与调控多种细胞信号过程；其激酶活性受到胞浆内环化一磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）水平的调控[4]。研究发现，PKA参与调控血小板凋亡[5]、血栓形成[6]、受体酶切[7]等过程。然而，PKA在调控血小板生理及病理功能中的确切作用尚不完全清楚。本文拟研究PKA活化对不同诱导剂诱导血小板聚集功能的影响，探讨PKA调控血小板活化的分子机制，为临床血小板功能异常相关性疾病及抗血小板药物的开发提供理论基础。

一、材料和方法

1.试剂与仪器

PKA活化剂Forskolin购自上海碧云天生物科技有限公司；血小板诱导剂Ristocetin,Thrombin,Collagen和ADP均购自美国Chronolog公司。实验中涉及到的缓冲液配置方法：ACD(acid citrate dextrose:2.5%trisodium citrate,2.0%D-glucose,1.5%citric acid);MTB(2.5 mmol/L Hepes,150 mmol/L Na Cl,2.5 mmol/L KCl,12 mmol/L NaHCO3,5.5 mmol/L D-glucose,1 mmol/L CaCl2,1 mmol/L MgCl2,pH 7.4),CGS(0.123 mol/L NaCl,0.033 mol/L,D-glucose,0.013 mol/L trisodium citrate,pH 6.5）。血小板聚集仪LOG700（美国Chrono公司）；低速离心机LDZ5-2（北京京立离心机有限公司）；台式低速离心机1-16（德国Sigma公司）；全自动血液分析仪XP-100（日本希森美康医用电子公司）；电热恒温水浴锅DK-S22（上海精宏实验设备有限公司）。

2.血小板洗涤

通过肘正中静脉抽取健康成年志愿者（其中男3例，女3例，平均年龄24.5±1.5岁）新鲜全血25 ml，按7∶1的体积比将全血与ACD抗凝剂轻轻混匀。设置离心力为200×g，离心11 min。收集上层富含血小板血浆（Platelet rich plasma,PRP）转移至1.5ml EP管，然后设置离心力900×g，离心2 min。弃上清液，加入1 ml CGS缓冲液重悬后，400×g离心2 min。弃上清液，加入适量MTB缓冲液重悬。血小板计数并调整血小板浓度为3×108/ml，按1∶1 000体积比分别加CaCl2和MgCl2。室温静置1-2 h[8]。

蛋白激酶A活化

取静置后的洗涤血小板置于聚集管中，每管250μl。加入不同剂量的PKA活化剂Forskolin至终浓度分别为2.5μmol/L,5μmol/L,10μmol/L，对照组加同等体积的DMSO。置于37℃下孵育5 min后，加入不同剂量诱导剂诱导血小板聚集。

血小板聚集

以MTB缓冲液作为对照，分别加入血小板刺激剂Ristocetin（终浓度为1.25 mg/ml）和v WF（终浓度为35μg/ml),Thrombin（终浓度为0.05 U/ml),Collagen（终浓度为5μg/ml),ADP（终浓度为2.5μmol/L），在37℃，200 g剪切力条件下诱导血小板聚集，每个点至少观察5 min。按比浊法（光学法）用血小板聚集仪测定血小板的最大聚集率。检测不同剂量Forskolin处理后Ristocetin,Thrombin,Collagen,ADP诱导的血小板聚集情况。

3.统计学分析

所用统计软件为Graph pad Prism 6。计量资料用均数±标准差的方式呈现，多组间比较用单因素方差分析（ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.PKA活化剂Forskolin对Ristocetin诱导的血小板聚集的作用

采用不同剂量的PKA活化剂Forskolin预处理洗涤血小板后，加入35μg/ml的血管性血友病因子（von Willebrand Factor,vWF），经1.25 mg/ml的Ristocetin诱导血小板聚集。结果发现，2.5-10μmol/L的Forskolin对Ristocetin诱导的血小板聚集无明显影响（P>0.05）（图1）。

2.PKA活化剂Forskolin对Thrombin诱导的血小板聚集的作用

采用不同剂量的PKA活化剂Forskolin预处理洗涤血小板后，经0.05 U的Thrombin诱导血小板聚集。结果发现，2.5μmol/L的Forskolin对Thrombin诱导的血小板聚集无明显影响；而5和10μmol/L的Forskolin均显著抑制Thrombin诱导的血小板聚集，且呈剂量依赖性（r=0.8892）（图2）。

3.PKA活化剂Forskolin对Collagen诱导的血小板聚集的作用

采用不同剂量的PKA活化剂Forskolin预处理洗涤血小板后，经5μg/ml的Collagen诱导血小板聚集。结果发现：2.5-10μmol/L的Forskolin均可显著抑制Collagen诱导的血小板聚集（P<0.001）（图3）。

4.PKA活化剂Forskolin对ADP诱导的血小板聚集的作用

采用不同剂量的PKA活化剂Forskolin预处理洗涤血小板后，经2.5μmol/L的ADP诱导血小板聚集；结果发现：2.5-10μmol/L的Forskolin均可显著抑制ADP诱导的血小板聚集，且呈剂量依赖性（r=0.9333）（图4）。

三、讨论

蛋白激酶A是最常见的丝氨酸苏氨酸磷酸化激酶之一，广泛分布于真核细胞中，参与调控多种细胞过程[9]。既往研究表明，蛋白激酶A参与调控血小板凋亡及活化过程[5,10]。本研究发现活化蛋白激酶A可不同程度的抑制诱导剂诱导的血小板聚集功能，进一步说明蛋白激酶A在调控血小板功能方面具有重要的作用。

当血管内皮破裂，血小板通过一系列有序的细胞和生化反应，通过与不同的配体结合，诱导活化参与凝血过程。血小板膜糖蛋白Glycoprotein(GP)Ib-IX-V复合物是血小板表面分布最为丰富的膜受体之一，其和通过与内皮损伤后暴露出的vWF结合诱导血小板的活化，此过程为血小板参与止血及凝血的其实过程，也是最为关键的步骤之一[11]。体外情况下，Ristocetin可有效诱导v WF与GPIb的结合，进而激活一系列下游信号通路引起血小板活化。此方法也常作为评价血小板聚集功能的常用指标之一。本研究结果显示，低剂量Forskolin轻度活化蛋白激酶A对GPIb介导的血小板聚集功能影响有限，这提示，其在作为开发抗血小板药物靶点方面具有潜在的应用价值。

凝血酶作为常见的血小板诱导剂之一，其诱导血小板聚集的主要方式是与血小板膜受体PAR-1和PAR-4结合；通过G蛋白偶联受体家族蛋白导致血小板活化[12]。而胶原诱导血小板聚集的主要方式是与血小板膜受体GPVI和GP Ib-IX-V结合；ADP的血小板膜受体是P2Y12和P2Y1[13,14]。本研究结果显示，活化PKA可显著抑制凝血酶/胶原及ADP诱导的血小板聚集。这提示，PKA在调控血小板聚集信号过程中起重要调控作用；而本研究又发现活化PKA对凝血酶/胶原及ADP诱导的血小板聚集的抑制作用各不相同，提示，PKA在调控血小板聚集信号过程中是多层次多方位的，既存在共同调控作用，在关键节点上也存在独立的效用。以上结果提示，本研究在应用针对PKA为靶点的抗血小板药物时，要做到全面综合考虑，尽量减少其带来的潜在副作用。

四、结语

综上，本研究PKA活化对不同诱导剂诱导血小板聚集功能的影响发现，PKA活化可显著抑制诱导剂诱导的血小板聚集功能，这将为临床血小板功能异常相关性疾病及抗血小板药物的开发等方面提供理论基础。

参考文献:

[8]吴夏,闫荣,赵丽丽,等.蛋白质二硫键异构酶对血小板膜蛋白Ibα酶切的调控作用.中国实验血液学杂志, 2015; 23(4):1069-1074.

江梦枭,刘俊,周康熙,叶红磊,胡仁萍,闫荣,阮长耿,戴克胜.蛋白激酶A活化对血小板聚集功能的影响[J].中国实验血液学杂志,2020,28(03):899-903.

基金:国家自然科学基金(81770117);江苏省科教强卫工程-临床医学中心(YXZXA2016002).