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大黄灵仙胶囊调控小鼠胆囊结石形成机制中BSEP、NTCP的蛋白基因及mRNA表达的研究

2020-08-20 535 上传者：管理员

摘要：目的：研究大黄灵仙胶囊调控小鼠肝胆管侧膜细胞上胆盐输出泵（BSEP）、钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白（NTCP）的蛋白及mRNA表达水平，干预胆囊结石形成的作用机制。方法：将60只SPF级C57BL/6雄性小鼠随机分为普食组（P组）、致石组（Z组）、致石+灌水组（Z+S组）、致石+大黄灵仙胶囊组（Z+D组）、致石+熊去氧胆酸组（Z+X组），每组各12只，喂养8周，1天/次。采取小鼠胆囊组织观察造模情况，运用WesternBlotting及RT-PCR技术对肝脏组织中BSEP、NTCP的蛋白及mRNA表达量进行分析并对比其差异。结果：Z组结石形成数多于P组，差异有统计学意义（P<0.001）。WesternBlotting:Z+D组和Z+X组BSEP、NTCP蛋白表达水平无明显差异（P>0.05),Z+D组高于Z+S组，差异具有统计学意义（P<0.05）。RT-PCR:Z+S组、Z+D组与Z+X组BSEP、NTCPmRNA的转录水平存在差异，Z+S组<Z+D组、Z+S组<Z+X组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：致石性饲料喂养可致小鼠胆囊结石形成，大黄灵仙胶囊可以增强小鼠肝胆管侧膜细胞上BSEP、NTCP的蛋白及mRNA表达水平干预胆囊结石形成。

关键词：
BSEP
NTCP
大黄灵仙胶囊
胆囊结石病
药学
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胆囊结石是胆道系统最常见疾病，主要为胆固醇结石。从过饱和的胆汁中沉淀出来的胆固醇结晶反应了肝脏中胆固醇分泌的高水平[1]，肝细胞分泌功能是通过肝细胞胆小管侧膜的转运蛋白来实现的，在众多的膜转运蛋白中，胆盐输出泵（bilesaltexportpump,BSEP）是介导胆盐摄取和排泄最重要的胆盐转运器[2]；钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白是位于顶浆膜上介导胆盐的重要因子，也是细胞摄取胆汁酸的主要载体系统[3]。BSEP与NTCP的协同作用在胆汁分泌和肝脏功能的正常运作中至关重要，是驱动胆汁酸盐肝肠循坏的重要动力。课题组前期证实大黄灵仙胶囊可以调控部分肝胆管侧膜细胞转运蛋白[4,5]，据此，本研究探讨大黄灵仙胶囊对BSEP、NTCP蛋白和mRNA表达量调控及防治胆囊结石的作用机制。

1、材料与方法

1.1动物

5周龄SPF级C57BL/6小鼠，雄性，体重（18±2)g（购于湖南长沙天勤有限公司，许可证号SCXK（湘）2014-0011），饲养于右江民族医学院动物实验室。实验室室内湿度：55%～75%，室内温度：20～25℃，12h黑白环境循环更替，实验一切操作严格遵守美国国立卫生研究院公布的《实验动物护理使用指南》（NIHPub.No.85-23,1996修订）。本研究动物实验通过右江民族医学院动物伦理委员会核查并审批。

1.2药物

大黄灵仙胶囊由广西中医药大学第一附属医院中药中学提供（桂药监注[2003]88号），麻醉药品由中国泰兴市豪申化工贸易有限公司提供（CAS:302-17-0），熊去氧胆酸购于四川科瑞德制药有限公司（国药准字H20123205），致石性饲料购于江苏美迪森生物医药有限公司（GB14924.3-2010）。

1.3主要试剂

Anti-BSEP抗体购于ThermoFisher公司，Anti-NTCP抗体购于ThermoFisher公司，β-actin抗体购于北京索莱宝生物科技技术有限公司，山羊抗兔的二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司，SDS购于上海碧云天生物科技技术有限公司。

1.4分组及造模

小鼠先于SPF级动物实验室饲养1周以适应饲养环境并确定小鼠健康状况，将60只小鼠随机均分为5组：普食组（P组）、致石组（Z组）、致石+灌水组（Z+S组）、致石+大黄灵仙胶囊组（Z+D组）、致石+熊去氧胆酸组（Z+X组）。普食组予以普通饲料喂养，余4组均予以致石饲料喂养[高脂、高热量、高胆固醇（15%脂肪、1.5%胆固醇、0.5%胆酸）]诱导方法造模8周，建立小鼠胆囊结石模型，此造模方法已被多次验证成功[6,7,8]。Z+D组给予大黄灵仙胶囊汤药灌胃，Z+X组给予熊去氧胆酸胶囊溶液灌胃，Z+S组则给予相同体积的生理盐水灌胃，药物剂量根据小鼠与成人体重等效剂量换算。取胆囊组织观察结石形成情况，小鼠胆囊内有颗粒状或泥沙状沉积物可判断为结石形成；取小鼠肝脏组织0.3cm×0.3cm×0.2cm装入EP管中暂时存放于液氮罐中，标本采取完成后统一保存至-80℃冰箱可进行下一步实验。

1.5Western-Blotting检测小鼠肝脏组织BSEP、NT-CP蛋白表达

提取小鼠肝脏组织蛋白并测定蛋白浓度，配平→蛋白质变性→制备SDS-PAG凝胶→上样、电泳→转膜→封闭、洗膜→一抗、二抗孵育→曝光→灰度值分析。蛋白条带见图1。

图1小鼠肝脏组织中BSEP、NTCP蛋白条带图

1.6RT-PCR检测小鼠肝脏组织BSEP、NTCP基因转录水平

引物的设计与合成→组织标本RNA的提取→RNA浓度的测定→将符合标准逆转录反应→将提取好的DNA进行上机→进行RealTimePCR反应。采用两步法PCR扩增标准程序→计算出各样品的目的基因相对定量结果，即其他各个样品相对于对照样品（以P为对照样本），目的基因mRNA转录水平的差异。

1.7琼脂糖凝胶电泳结果

浓度测定后应用琼脂糖凝胶电泳测定所提取RNA完整度，结果见图2。紫外灯下可见各组样本28s、18srRNA两条条带，条带清晰、明亮、边缘完整，且28s条带宽度约为18s条带的两倍。所以认定所提取的RNA完整性好，无污染，无降解。

图2各组琼脂糖凝胶电泳结果

1.8统计学方法

采用SPSS22.0软件进行统计分析，造模情况为计数资料，蛋白及mRNA表达量为计量资料；计数资料（样本量少）采用四格表资料的Fisher确切概率法检验，计量资料采用（x±s）表示，多个样本间的比较采用单因素方差分析（one-wayANO-VA），根据方差齐性检验，方差齐否分别使用LSD法和Games-Howell法，P<0.05差异有统计学意义。

2、结果

2.1结石形成情况

小鼠胆囊内有颗粒状或泥沙状沉积物可判断为结石形成，本次实验显示多为泥沙状沉积物，个别为颗粒状（见表1、图3）。不仅如此，所有致石饲料喂养的小鼠胆囊直径大于对照组（图3:Z为造模组，P为普通喂养组）。通过统计学分析发现：P组与Z组差异有统计学意义（χ2=20.308,P<0.001），造模成功；Z+S组与Z+D组比较，两组差异有统计学意义（χ2=8.224,P<0.05),Z+X组与Z+D组比较差异无统计学意义（χ2=0.000,P>0.05），说明大黄灵仙胶囊、熊去氧胆酸具有防治胆囊结石形成作用，且两种药作用结果相当。

表15组造模结果

图3胆囊结石造模图

2.2小鼠肝脏组织中BSEP、NTCP的蛋白表达水平

造模8周后，对比Z+X组、Z+D组、Z+S组肝脏组织中BSEP、NTCP的蛋白表达量发现：Z+D组>Z+S组、Z+X组>Z+S组，差异具有统计学意义（P<0.05），但Z+D组与Z+X组比较差异无统计学意义（P>0.05），见表2、图4、图5。（注：此次实验分为5组，P组和Z组比较用于验证造模，Z+S组、Z+D组和Z+X三组比较用于验证BSEP、NTCP蛋白、mRNA转录表达水平，故下列只列出Z+S组、Z+D组、Z+X组信息。）

表2小鼠肝脏组织BSEP、NTCP的蛋白表达水平对比

图4小鼠肝脏组织中BSEP蛋白表达量柱形图

图5小鼠肝脏组织中NTCP蛋白表达量柱形图

2.3小鼠肝脏组织中BSEP、NTCP的mRNA表达水平

造模8周后，对比Z+X组、Z+D组、Z+S组肝脏组织中BSEP、NTCPmRNA转录水平发现：Z+D组>Z+S组、Z+X组>Z+S组，差异具有统计学意义（P<0.05），但Z+D组与Z+X组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表3、图6、图7。

表3小鼠肝脏组织BSEP、NTCP的mRNA表达水平对比

图6小鼠肝脏组织中BSEPmRNA转录柱形图

图7小鼠肝脏组织中NTCPmRNA转录柱形图

3、讨论

大黄灵仙胶囊具有较好的预防结石形成的作用，本研究证实其调控小鼠肝胆管侧膜细胞上BSEP、NTCP的蛋白及mRNA表达水平干预胆囊结石形成，另一可能机制为抑制胆囊黏膜炎症及上调肝组织中CYP7A[9,10]，李泉等[9]在临床实验中，通过B超随访提示患者胆囊收缩功能较术前明显改善，综合实验研究与临床观察结果表明，在保胆取石术后病人中，大黄灵仙胶囊有提高胆石症手术疗效、降低胆石症术后残石率及复发率的作用。熊去氧胆酸是一种亲水性胆汁酸[11]，可以抑制胆固醇在肠道内的重吸收，并且降低其向胆汁中分泌，抑制胆汁中胆固醇过饱和，胆固醇结石逐渐溶解，最终防止胆囊结石生成。大黄灵仙胶囊具有疏肝利胆功效，协调胆道系统功能，且有保护肝脏组织和促进肝功能，即使采用致石性饲料灌胃，由于分泌较多胆汁冲刷胆道，不利于胆固醇成核异常；大黄灵仙胶囊可能保护胆囊功能，不致胆汁淤积，综上，熊去氧胆酸、大黄灵仙胶囊都有抑制结石形成作用。所以Z+D组、Z+X组结石生成率相当，均低于Z+S组，差异有统计学意义。

NTCP作为一种跨膜糖蛋白，介导门脉结合胆汁酸进入肝细胞，维持胆汁酸肝内循环和肝内胆汁酸正常浓度发挥重要作用，在转录水平NTCP主要受FXR核胆酸受体调控[12]。BSEP是肝内胆汁酸清除的关键因素，胆汁淤积性药物性肝损伤（DILI）患者大多BSEP表达显著下调[13]。Z+D组BSEP、NTCP蛋白表达及mRNA转录都有提高，稳定了胆汁酸转运蛋白表达，抑制胆汁淤积，稳定了胆汁酸池浓度平衡及肝脏分泌胆汁水平。大黄灵仙胶囊防治胆囊结石形成在于影响肝胆管转运蛋白表达，此实验只对BSEP、NT-CP两个因子蛋白、基因表达水平做研究，如果可以从调控BSEP、NTCP两因子的信号通路着手，对基因进行检测，将更具特异性及说明意义。

参考文献：

[4]唐乾利,吕震,王兵,等.大黄灵仙胶囊调控ABCB11和ABCC2干预胆结石形成的作用机制研究[J].重庆医学,2018,47(1):4-10.

[5]唐乾利,吕震,俞渊,等.大黄灵仙胶囊调控胆结石小鼠肝细胞转运蛋白表达及胆汁代谢谱的机制研究[J].中国中西医结合杂志,2016,36(8):953-959.

[6]黄名威,唐乾利,赫军,等.大黄灵仙胶囊对胆结石豚鼠肝组织超微结构及CYP7A1mRNA表达的影响[J].中医杂志,2010,51(9):837-839.

[7]吕震,俞渊,王兵,等.大黄灵仙胶囊对小鼠胆结石形成及肝病理和血液生化指标的影响[J].医学研究生学报,2016,29(6):577-581.

[8]唐乾利,黄炜,黄名威,等.大黄灵仙胶囊对胆结石防治作用机制的实验研究[J].中国临床新医学,2012,5(2):93-97.

[9]李泉,俞渊,黄欣,等.大黄灵仙胶囊预防保胆取石术后结石复发的基础与临床研究[J].右江民族医学院学报,2014,36(2):161-164.

[10]周洋,卓臣义,唐乾利.胆囊结石形成机制及诊疗现状研究[J].右江民族医学院学报,2019,41(2):203-206.

周洋,卓臣义,唐乾利,冯时,岑小宁,包崇婵,黄丽芳,许彦.大黄灵仙胶囊调控小鼠胆囊结石形成机制中BSEP､NTCP基因表达的研究[J].右江民族医学院学报,2020(04):401-405.