第一章 绪论

1.1氧化石墨烯(GO)简介

石墨烯是由碳原子(sp2杂化)规则排列而组成的一种六角蜂窝状的二维晶体，是严格意义上的二维结构,这种二维材料构成了一种新的纳米碳。它具有出色的机械强度、良好的电导率和生物相容性等优异性能，这些优异的性能使它可用于例如光电器件、能量存储和药物输送中。但是由于石墨烯的合成较为困难、溶解性相对较差和较难加工等原因，使其应用受到了很大的限制0.8。自1859年第一次合成氧化石墨烯(GO)以来，已经有许多方法(如Standenmaier法、Brodie法和Hummers法等)可以合成GO[19-12]，所使用的这些方法中，它们的共同特点是在合成过程中混合强氧化剂对石墨进行剥离得到GO。通常情况下，GO是石墨烯的重要衍生物之一，与石墨烯相比，GO具有不同的独特性质，使其受到越来越多的关注，GO不仅具有石墨烯的二维结构，而且它的表面含有大鼂如羟基、羧基和羰基等含氧官能团[13,15]，这些含氧官能团使得GO具有良好的水分散性。此外，含氧官能团使得GO的衰面易于修饰并且可与其它材料产生强烈地相互作用，使其可以应用于许多领域中[16-18]。

1.2石墨烯量子点(GQDs)简介

GQDs代表了一类具有独特性质的新型碳量子点，是一种具有石墨烯和碳点特征的零维材料，其可被视为尺寸小于10nm的小片石墨烯[21],其优异的性能将有望成为传统半导体量子点(QD)和有机染料在生命科学领域中潜在的替代物[22]。GQDs不仅具有石墨烯的薄层晶体结构，而且晶格间距在0.21nm左右，厚度在10个原子层以内。GQDs.在一定的激发光波长激发下可以发射出明亮的荧光，其中，蓝色和绿色荧光是最为常见，近年来也有在一定激发条件下发射出红色荧光的GQDs见诸于报道[23]。GQDs的荧光(PL)性质虽然受多种因素如尺寸大小、元素组成、表面官能团、边缘状态和碳骨架结构中的缺陷等影响[24],但是其荧光性质在生物研究中引起了越来越多的关注。与GO不同的是，GQDs表面上存在更多的活性基团使其易于被修饰，从而具有更多的独特性质。近年来，由于GQDs具有优异的各种化学性能[27],使其在生物标记、靶向药物递送、生物成像和光动力疗法等方面的应用倍受关注[28-30]。

1.3氟化石墨烯量子点的简介

GQDs具有优异的性质，杂原子掺杂GQDs可以进一步调节它的能帶结构，从而产生意想不到的特性。到目前为止，GQDs已迅速开发用于太阳能电池，光电探测器，生物成像和发光二极管。为了进一步扩展GQDs的应用，掺杂杂原子是一种有效的材料改性方法。通过掺杂，可以有效地设计GQDs中的可调间隙，修改表面结构，并添加其他官能团以实现化学功能化。氟是周期表中的一个小原子，由于其高电负性，因此在调节碳材料的化学、结构和电子特征方面具有强大的作用。用氣修饰石墨烯可以赋予石墨烯独特的电子[31,32]、发[33,34]、磁性[33.36]、电化学[37,38]和生物学功能[59,40]等。由于杂原子掺杂石墨烯量子点的制备方法和性质与GQDs的类似，因此，以下参照GQDs的制备方法与性质进行讨论。

1.4CQDS的设备方法

当前，合成GQDs的方法可以分为两大类:“自上而下”(Top-down)法和“自下而上”(Bottom-up)法(如图1.1)[42]。“自上而下”法包括通过浓酸氧化、水热处理、溶剂热处理、电化学切割和微波辅助切割等物理、化学或电化学过程裂解例如石墨、石墨烯、氧化石墨烯、碳纳米管、碳纤维甚至煤炭等碳质材料([41,43],这类方法具有原料丰富和操作简单等优点。通过“自上而下”法制备的GQDs通常在边缘富含官能团，便于GQDs的后续修饰，因此，大多数的合成都基于“自上而下”法，但是，“自上向下”法制备的GQDs存在产量低、石璺烯结构会受到损坏以及形态不均匀等问题而受到影响。而“自下而上”法是以小分子开始的一系列化学反应合成的，常用的原料有柠檬酸、酒石酸与苯衍生物纂[44,45]。与“自上而下”法相比较，“自下而上”法的合成方法相对较少，包括微波加热法、热解法和水热法等，通过使用“自下而上”法合成的GQDs,虽然操作复杂，产率较低，但是可以对GQDs的尺寸和形貌进行可控化合成。

1.5GQDs的结构与性质

1.5.1GQDs的结构

GQDs和碳点在结构上是不同的，碳点是准球形的纳米粒子，直径通常在10nm以下，GQDs的横向尺寸范围--般为1.5-60nm，厚度在10个原子层以内，并且GQDs中碳与碳的连接十分紧密，可以形成稳定的六角形结构(图1.6)。近几年来，很多科学家用不同方法将石墨烯片合成为GQDs，并对其量子限域效应和边界效应所诱导的新现象进行了广泛的研究，进而可以将GQDs应用在生物医学、光电器件、光催化、抗菌系统和环境检测等领域。虽然大多数已经合成的GQDs的形状为圆形或椭圆形，近期也有形状为三角形、方形和六边形的GQDs被报道出来[52-54]。GQDs不仅具有和GO相同的优异性能，并且在实验上GQDs也被证实拥有较好的生物相容性，同时，GQDs比一维的碳纳米管及二维的石墨烯片表现出更强的量于限域效应和边界效应，因此，GQDs在生物医学、磁性材料、光学材料、光电器件和环境检测等领域具有广阔的应用前景[55-57]。

1.5.2GQDs的光学性质

紫外可见吸收性质:一般情况下，GQDs在230nm附近的紫外-可见区域可以表现.出较强的光吸收，主要归因于C=C键的π~π跃迁，此外，还可以观察到在270-360nm的肩峰，这归因于C=O键的n-r*跃迁引起的[58]。通常，GQDs的吸收峰位置和发射峰大小会受到衰面官能团和边缘缺陷的协同影响。在不同的激发光波长照射下，GQDs可以显示出不同的荧光发射行为(如蓝色、绿色、黄绿色、黄色和红色)，这对于它们在生物成像中的应用至关重要[23,59,60]。

光致发光特性:近几年来，GQDs的光致发光性能得到了广泛的关注。光致发光具.体是指受到一定波长光激发后的电子从基态跃迁至激发态，然后回落至基态时，通过辐射释放出光子的现象[61-63]。GQDs的光致发光光谱通常呈现出较宽的发射带，从紫外区域可以覆諞到可见光区域，相应的光致发光激发光谱由两个或更多个峰组成，光致发光的强度取决于本征态发射和缺陷态发射的竞争。近年来，通过不同方法制备的GQDs一般都表现出一定程度的光致发光行为。研究表明，不同尺寸的石墨烯碎片具有不同的HOMO-LUMO帶隙，并且帶隙随着其尺寸的改变而发生变化，结果导致不同尺寸的GQDs拥有不同的激发和发射峰，随蓍激发波长的改变，其荧光发射峰位置也随之发生改变。邇常，随着粒子的变小，发光能量蓝移至更高的能量。GQDs的尺寸改变会导致最高占有分子轨道和最低未占有分子轨道(HOMO-LUMO)能级的不同，这些能级随着GQDs的尺寸不同而发生相对程度的改变。另外，GQDs和半导体量子点的光致发光之间的主要区别在于,GQDs中的PL带宽要宽得多，并且它们的PL最大值可红移到红色，并隨着激发波长的增加而减小。GQDs.上的官能团可影响其发光性质，因此，在GQDs上引入官能团可以改变其荧光特性。

Pan等人[41]通过水热方法制备了发射出蓝色荧光的GQDs，并且随蓍激发波长的增大，GQDs的荧光峰不断的发生红移，表现出明显的激发波长依赖性的光致发光行为。GQDs的荧光强度除了受尺寸的影响外，GQDs水溶液的pH值也会影响其荧光强度，在碱性环境中，GQDs具有很强的荧光，在酸性条件下，其荧光几乎被完全淬灭，如图1.7所示，如果将GQDs水溶液的pH值反复地在1-13之间进行调节，荧光强度会隨之发生改变，并且这种改变是可逆的，然而该现象可能会限制GQDs的进一步应用。Shen等人[64]以GO为原材料，以聚乙二醇为钝化剂，制备出表面钝化的GQDs,有效的改善了上述问题，该法制备的GQDs在中性溶液中呈现出强荧光，在酸性和碱性条件下其荧光强度只是减少到25%，进一步研究发现该法制备的GQDs展现出卓越的光学性能，荧光量子产率为28%，此外，还有很多影响GQDs荧光性能的因素有待进-步研究。

1.5.3GQDs的其他性质

除了光学性能，人们还研究了GQDs的催化性能[27.5]。并且碳原子作为一切生物有机体的骨架元素，相对于其他元素构成的荧光纳米材料而言，GQDs的毒性较低且具有良好的生物相容性，并且可以通过细胞内吞进入细胞内部而不影响细胞核的正常工作，而且还可以与DNA筹生物大分子相互作用，从而来进行一系列的生物分子的识别与检测66.6]。为了扩展GQDs的应用，除了上述提到的性质之外，人们还研究了GQDs的许多其他的性质，由于这些优异性质的存在，使得GQDs可以成为多模式生物成像的良好平台[68-70]。

1.6GQDs的生物医用研究

1.6.1GQDs在生物显影中的应用

对GQDs的生物成像进行研究之前，首先需要评估GQDs的生物相容性，GQDs的粒径和浓度是影响GQDs生物相容性的两个主要因素。通常，评估生物相容性主要从两个方面进行考虑:细胞毒性和体内孝性实验，细胞瘴性实验通常选择单细胞个体为研究对象，而体内毒性实验则选择整个生物体作为研究对象。

GQDs的细胞毒性:目前，已经评估了合成的GQDs(如GQDs、言能化的GQDs和杂原子掺杂的GQDs)的细胞毒性。使用方法通常为MTT检测法、细胞增殖/辈性检测试剂盒(CCK-8)、乳酸脱氢酶试剂盒(LDH)、水溶性四唑盐试剂(WST-I)等来评估细胞的细胞毒性实验，一般情况下，GQDs是具有低细胞壽性的纳米材料[72.73]。Wu等人[74]合成了一种GQDs，与GO相比较，GQDs进入细胞相对容易，并且GQDs的细胞毒性远低于GO,GQDs的细胞毒性大小可以从细胞内ROS的含量、线粒体膜电位的大小以及对细胞周期的影响得到证实。Zhu等人[75)通过-步溶剂热法从GO合成了强绿色荧光发射的GQDs，该GQDs在水和大多数极性有机溶剂中具有良好的分散性，并且合成的GQDs包含许多化学基团如-OH、C=O和_CO-NR2，它们源自DMF的分解，因此，它们具有较高的溶解度，无需对其进行化学修饰。

为了评估GQDs的细胞毒性，Jiang等人[73]使用了一些典型实验方法，例如CCK-8分析、LDH分析和ROS分析法，该课题组通过CCK-8分析法测试发现随普GQDs浓度的增加细胞存活率逐渐降低，在21.5至50ugmL:I的浓度范围内可以观察到90%以上的细胞存活率，在浓度为200μgmL-时，仅只有80%的细胞存活率，这表明了GQDs的浓度处于较低水平时，可以表现出良好的生物相容性和低细胞毒性。此外，也有报道称细胞中LDH的水平含量可以表明细胞膜的完整性，证明GQDs的细胞毒性可以通过LDH分析得到进-步的证实[76]。

Sun课题组177]采用-种简单、快速和优化的水热方法，在过氧化氢的辅助下从GO制备得到了GQDs,合成的GQDs不仅可以显示出良好的水分散性和优异的光学性能外，该GQDs还显示了低的细胞毒性和良好的的生物相容性。并且通过对三种模型细胞系(巨噬细胞、内皮细胞和模型癌细胞系)进行成像研究，结果证明该GQDs可以作为荧光纳米探针的应用，从而表明它们在生物成像和诊断中具有应用潜力。

GQDs的体内毒性:尽管使用体外细胞培弹的方法来评估GQDs的细胞毒性是简单有效的，但仍然有必要评估材料在体内的毒性。体内毒性测试主要涉及诸如被测物质在整个生物器官之间的分布、通过排泄系统清除的可能性以及对器官的任何可能损害等问题。Wu等人[78]由“自下而上”法合成GQDs具有在小鼠体内成像的潜力，但是，他们没有进一步研究GQDs的体内毒性。Nurunnabi等人[79]进行了系统的体内毒性研究，他们首先通过碳纤维剥离合成GQDs，研究了在小鼠的体内成像、生物分布和离体有机成.像，体内成像显示，在肿瘤部位注射后，可以检测到GQDs,但是从深部器官中未检测到荧光信号，这表明GQDs可用于浅表组织成像(例如皮肤癌检测)，注射24小时后，在肿瘤部位或小鼠身体任何部位均未检测到GQDs(图1.8)，并且提取的器官(即肾脏，肝脏，心脏等)的离体成像显示，GQDs在最初的12h内通过循环系统敬布到整个身体，在此期间，例如在早期阶段(2h)，GQDs主要在肝脏和心脏中积累，在不同器官中逐渐缓慢积累，大约在12h后，GQDs在肝脏中的积累慢慢变少，而肾脏中的积累显著增加，一般情况下，与12h相比，GQDs在24h的荧光信号减弱，结果表明，排泄系统可以方便地排出GQDs。然而，在体外研究证明，GQDs的化学官能团的改变可以与有机体的相互作用产生显著的差异，因此，这些体内研究作为GQDs生物相容性综合指标的有效性仍是不确定的，他们继续用大鼠模型证明了组织的全血细胞计数，血清生化分析和组织学分析，在22天内，GQDs注射组与对照组之间没有显蔷差异，从而可以得出GQDs体内毒性较低的结论。Zhang等人(80全面研究了GQDs的理化特性，结果同样显示出GQDs具有良好的体外和体内生物相容性。

1.6.2GQDs在药物递送中的应用

GQDs由于具有大的比表面积、低的生物毒性和良好的生物相容性等优点，因此可以通过物理或化学方法将药物负载在GQDs.上使其作为药物递送的载体[85-87]。AngelaDiPietro课题组[86]通过剥落多璧碳纳米管(MWCNT)合成了具有高度分散和水溶性的GQDs，并将其与肿瘤靶向模块生物素(BTN)进行共价连接，然后，将药物阿霉素(DOX)靶向递送至癌细胞。首先对A549细胞进行的生物学测试表明合成的载体(GQDs和GQD-BTN)毒性非常低，在GQD-BTN-DOX处理的癌细胞中，相对于缺乏靶向的GQD-DOX和仅使用于游离的DOX的癌细胞中，细胞毒性依赖于细胞摄取的GQD.BTN-DOX释放的DOX浓度，通过细胞毒性结果可以观察到细胞毒性随着GQD-BTN-DOX的浓度的增加而逐渐增加。因此，GQDs可以用作载体负载药物作为药物递送系统。

1.6.3GQDs在肿瘤光动力治疗中的应用

光动力疗法(PDT)是--种针对癌细胞选择性破坏的非侵入性治疗方法。在光动力治疗中光敏剂(PS)起着关键作用8088.89。如图1.12所示，在PDT的过程中，PS吸收一个具有适当波长的光子，并使其从基态(So)转变为第一单重态激发态(S1)或第二单重态激发态(S2),S2将通过内部转换(IC)迅速衰减(=fs)到Si,SI的生命周期也为纳秒级别，因此也是不稳定的，并且会因IC处理过程中的发光(荧光)或发热而失活。同时，Si也可能经历系间窜越(ISC)以形成更稳定的激发三重态(T),T1还可以通过电子转移机理与细胞内底物(例如核酸、蛋白赝和脂质)反应形成自由基，这些自由基进一步与H2O或O2反应生成其它活性氧(ROS)，例如羟基自由基(OH')和超氧自由基(O2^)，该过程定义为pDT类型过程[90.91]。PS吸收适当波长的光子能量并转移到其激发态，通过从激发的PS转移的能量产生诸如'O2的ROS物质进而杀死癌细胞。

与传统的肿瘤治疗方法相比，PDT具有能够精准有效地治疗且副作用较小的优势，目前，PDT可被临床用于治疗多种癌症192-95](如食道癌、皮肤癌和早期肺癌等)。2014年，Ge等人(28]报道了GQDs用于PDT中的应用，采用聚噻吩衍生物(PT2)为碳源的水热方法，大鼂制备了具有高度水分散性的GQDs,并且GQDs在紫外可见区域表现出较宽的吸收，并在680nm处出现强发射峰。该GQDs具有从可见光到近红外的广泛吸收、具有良好的水分散性、较高的光稳定性和良好的生物相容性等,如图1.13所示，用GQDs染色HeLa细胞会导致细胞产生强烈的PL发射，相应的荧光图像表明GQDs可以标记细胞质，而没有进入到细胞核中，这种现象与大多数已报道的碳点的细胞成像类似[96.97]。该合成的GQDs不仅可以用于细胞成像，而且由于在这些实验中，还加入了Hoechst33342来染色细胞核。如图1.13所示，与GQDs共培养并且进行激发光照射后，可观察.到细胞形态发生变化，包括细胞萎缩和大量气泡的形成，因此，可以表明可用于光动力治疗研究。

1.7本论文的选题意义和研究内容

GQDs是纳米级的石墨烯碎片，不仅具有石墨烯的性质，而且具有置子点的独特性质。由于GQDs的化学性质较为稳定并且具有较好的生物相容性和较低的细胞毒性等优点，在过去的十几年中，GQDs在化学、物理、材料、生物学和跨学科科学等方面的研究得到了全面开展。在GQDs的众多优异性质中，荧光性质和作为PS研究最为广泛，而掺杂杂原子的GQDs不仅可以改变GQDs的荧光强度、结构稳定性及溶解性还可以提高'O2产率筹，因此，杂原子掺杂GQDs已经成为新的研究热潮，但是含氟GQDs的合成及其在生物成像和光动力治疗中的应用并不多。本论文致力于通过氧化切割法合成F-Doped GQDs和FGQDs，并进一步探究其在生物成像及其肿瘤光动力治疗中的应用研究。

本论文的主要研究内容如下:

在第二章实验部分中，通过Hummers方法合成GO-1作为前驱物，然后与氟化铵混合利用双氟水进行氧化切割得到F-Doped GQDs，对照组中不加入氟化铵扈接在双氧水中进行氧化切割得到GQDs-1。然后在第三章内容中利用TEM、XPS、UV-Vis和PL等手段，对所获得的F-Doped GQDs和GQDs-1的形貌结构和表面基团进行了表征，结果显示F-Doped GQDs和GQDs.1的平均尺寸分别在2.9nm和2.5nm左右，其内部均可观察到明显的石墨化结晶碳的晶格衍射条纹，并且F-Doped GQDs氟掺杂量为1.21%。在光学性能上，F-Doped GQDs和GQDs-1均可以亵现出非激发光波长依赖性的荧光发射行为，同时以硫酸喹啉作为参比，测得F-Doped GQDs和GQDs-1在水溶液中的荧光最子产率(QY)分别为12.3%和10.4%。此外，将F-Doped GQDs和GQDs-1与各种相同摩尔浓度的不同金属离子(K+、Gd2+、Ba2+、Sn+、Mn2+、Cu2*、Fe+)溶液混合观察其荧光强度的变化时，F-Doped GQDs可以衰现出一定的离子选择性。然后，对合成的F-Doped GQDs和GQDs-1在生物显影方面进行了如下研究:采用HepG2和Hela为2D细胞模型进行了细胞毒性研究，当材料的浓度高达300ugmL'时，细胞的存活率仍然可以达到80%，由此证明F-Doped GQDs和GQDs.1具有较低的细胞毒性。随后，采用HepG2细胞和Hela细胞为2D细胞模型进行了细胞显影测试,发现在与浓度为200ug.mL:1培养6h时，F-Doped GQDs和GQDs-1在细胞中都可以发出明亮的荧光，但是，F-Doped GQDs在细胞中的显影效果相对较好。进而,我们又用HepG2为HepG23DMCs模型研究了材料在细胞团中的显影效果，同样F-Doped GQDs和GQDs-1与HepG23DMCs共培养6h时，F-Doped GQDs可以呈现出明亮的荧光，表明F-Doped GQDs具有良好的细胞显影效果。

在第二章实验部分中，通过Hummers方法合成FGO作为前驱物，然后通过双氧水进行氧化切割得到FGQDs，对比样以石墨为原料进行合成得到GQDs-2。然后在第四章内容中利用TEM、XPS、UV.Vis、PL和ESR等手段，对所获得的FGQDs和GQDs.2的形貌结构，表面基团进行了表征，结果显示FGQDs和GQDs-2的平均尺寸分别在2.1nm和3.6nm左右，并且FGQDs的水溶液在365nm的激发波长下激发时可以发出明亮的绿色荧光，同时以硫酸喹啉作为参比，测得FGQDs和GQDs-2在水溶液中的QY分为13.7%和5.8%，此外，FGQDs具有非激发光波长依赖性。在生物应用方面，采用HepG2细胞为2D细胞模型进行了细胞毒性研究，当材料的浓度高达300ugmL:'时，FGQDs在细胞的存活率仍然达到85%。因此，相对于GQDs-2而言，FGQDs具有较低的细胞毒性。进而又采用HepG2细胞为2D细胞模型进行了细胞显影研究，结果发现与FGQDs共培养6h时，细胞的显影效果达到最好。同时，我们又用HepG2为HepG23DMCs研究了材料在细胞团中的显影研究，同样FGQDs与HepG23DMCs共培养6h时，HepG23DMCs可以是现出明亮的荧光，表明FGQDs具有良好的细胞显影效果。

将FGQDs和GQDs-2水溶液利用ESR在LED光诱导下产生'O2的能力进行了研究，发现随着光照时间的增加，FGQDs在LED灯光照下可以产生逐渐增高的'O2信号，而GQDs-2的信号增加的相对缓慢，进而，以RB作为参比，ABDA为捕获剂,通过UV-Vis测试绘制吸光度与光照时间的工作曲线评估了'O2的产生能力，得出FGQDs和GQDs-2的O2产生能力分为0.49和0.24。然后，以HepG2细胞为模型使用MTT法检测LED灯光诱导下FGQDs和GQDs-2的细胞毒性，发现在同一光照条件下，随着浓度的增加，FGQDs的细胞毒性比GQDs.2的细胞毒性明显，进而用HepG23DMCs模拟肿瘤微环境，发现与FGQDs共培养时，肿瘤的大小隨蓿光照时间的增加体积逐渐变小，因此，FGQDs相对于GQDs而言具有良好的抑制肿瘤生长的作用。

第二章 实验方法与表征测试手段

2.1实验材料与仪器设备

2.2样品制备

2.2.1石墨烯量子点(GQDs-1和GQDs-2)的合成

氧化石墨烯(GO-1)和石量烯量子点(GQDs-1)的合成:采用Hummers方法[60]合成GO。具体操作如流程图2.1。氧化石墨烯(GO-2)与石墨烯量子点(GQDs-2)的合成:使用Hummers方法[101合成GO-2，具体操作如流程图2.2。

2.2.2氟化铵辅助合成氟掺杂石墨烯量子点(F-Doped GQDs)

氟化铵辅助氟掺杂石墨烯量k子点(F-Doped GQDs)的合成:称取上述合成的GO-1,溶解在50mL超纯水中，并在超声机中处理至少2h,然后，加入60mLH2O2和10mL(含有100mg氯化铵)水溶液，同时加入100μL30%的氨水，搅拌充分后，用温度为70°C的油浴锅进行回流处理4h，回流结束后，在皇温条件下将溶液冷却至皇温，然后用孔径为0.22um的水性滤膜抽滤处理数次以除去不溶性大颗粒。然后用透析袋(保留分子量:500Da)透析三天除去小分子，最后，将透析后的溶液在-60°C真空条件下冷冻干燥得到棕黑色F-Doped GQDs用于后续实验，搡作如流程图2.3。

2.2.3由氟化石墨制备氟化石墨烯量子点(FGQDs)

氟化氧化石墨烯(FGO)与氟化石墨烯量k子点(FGQDs)的合成:使用Hummers方法10]合成FGO，具体操作如流程图4。

2.3主要表征与测试手段

(1)样品的结构和组成通过X射线光电子能谱仪的傅里叶变换红外(FTIR)光谱仪、配备有532nm激光线的NEXUS-870拉曼光谱仪进行表征;(2)透射电镜(TEM)和高分辨透射电镜(HRTEM)用于表征样品的形貌和晶体结构;(3)电子顺磁共振波谱仪(ESR)用于评估光照射样品产生的'O2的信号强度;(4)分别使用UV-1800PC分光光度计和荧光分光光度i计(F-4500,Hitachi)记录紫外可见(UV-Vis)光谱和荧光发射(PL)光谱;(5)OlympusIX-51荧光倒置显微镜(Olympus，东京，日本)记录2D细胞和3D细胞团的荧光图像;(6)LeicaTCSSP8X记录细胞摄取样品后的激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)图像;(7)使用酶标仪评估细胞毒性和光照射细胞的细胞奪性;(8)BD流式细胞仪(FACSCalibur)用于定最分析细胞摄取材料后的荧光强度。

2.4实验部分

2.4.12D细胞与3DMCs的来源与培养

2D细胞和3DMCs来源:北京中国科学院生物物理研究所张宏老师提供了人肝癌细胞(HepG2)，中国科学技术大学生命科学学院王育才老师提供了人宫颈癌细胞(HeLa)。

2D细胞培养:首先,将HepG2细胞和HeLa细胞用DMEM培弊基进行培葬,DMEM培养基是用体积比为90%的高糖DMEM、10%的胎牛血清和1%青獰素链霉素溶液进行配制的，在进行培养过程时要把含有细胞的培养皿放置于37°C，含5%CO2的细胞培养箱中，直到细胞生长到整个皿的85%左右时，用PBS对细胞进行冲洗，清除溶液中的死细胞和没有贴壁的细胞，然后加入200uL胰蛋白酶溶液进行细胞消化处理，并且放入培葬箱60s左右，然后从细胞培养箱中取出后放置在倒置显微镜下进行观察，直到细胞逐渐变圆润且有成片的细胞从培养m底部开始脱落，最后加入2mLDMEM培养基终止细胞消化，反复吹打细胞形成单细胞悬液，然后根据实验要求培养细胞。

HepG23DMCs的培养:首先在细胞培养m的底部覆盖-层PolyHEMA薄膜。具体操作如下:在37°C水浴锅中搅拌至完全溶解含有0.45gPolyHEMA的30mL含有95%的乙醇溶液，然后在每一一个培养皿中加入约2mL.上述溶液至底部完全覆盖，放在37°C烘箱待液体完全挥发并在底部形成-层透明的凝胶时转移到超净台进行紫外照射消奪。

进行HepG23DMCs培养时，将贴壁生长的HepG2细胞用胰蛋白酶消化后，取约1x10°个细胞添加到处理过的培养皿中，并放置于37°C，5%的CO2的细胞培弊箱中进行培养，每天进行观察确定是否需要进行换液处理，长到第七天时直径约为400-500um的HepG23DMCs可以自发形成。

2.4.2MTT方法检测细胞毒性

MTT对细胞毒性检测:材料对HepG2细胞的细胞毒性现象可以通过使用MTT法进行评估。实验过程时首先将细胞以1x104个细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板中，并且每孔均含有100μL已配制好的DMEM培养基，并在37°C含有5%CO2气氛中培养12h(细胞达到70-80%汇合)。进行样品处理时首先将样品进行紫外线灯照射，之后完全分散在PBS(pH7.2-7.4)中以进行进一步研究，其次，将样品以不同的浓度(0、50、100、150、200、250、300、300ugmL:l)添加到每个孔中，隨后共培养24h,然后，在黑暗中向每个孔中添加10uLMTT(在PBS中的浓度为5mgmL'),再继续培养4h,最后，移液枪吸出上清液后在每个孔中加入150uLDMSO，然后在摇床上摇晃15min,最后使用酶标仪(CMAXPLUS)在630nm的参比波长下记录563nm处的光密度(OD),实验独立重复三遍，细胞毒性可用样品孔的吸光度与未处理对照孔的吸光度之比进行表示。

2.4.32D细胞显影和HepG23DMCs显影的实验方法

HepG2细胞的显影研究:首先将处于贴壁生长的HepG2细胞进行传代处理，然后以10x104细胞每孔的密度接种到六孔板中，并放入37°C，5%的CO2的细胞培养箱中进行培养12h,把F-Doped GQDs和FGQDs用DMEM配置成浓度为200ugmLl的溶液，然后弃去六孔板中的上清液并用PBS冲洗细胞两次，替换成上述已配制好的溶液，放回培弊箱分别继续培葬不同时间，培养结束后，使用移液枪吸出上清液，然后用PBS.冲洗细胞多次，以除去没有进入细胞的样品，然后选择荧光强度强的细胞皿.进行激光共聚焦拍摄，光学激发设置为405nm(CLSM,LeicaTCSSP8X)。FGQDs的HeLa细胞显影成像，操作过程与用上述HepG2细胞显影操作步骤相同。HepG23DMCs的显影研究:将直径生长到400-500um的HepG23DMCs转移到底部被PolyHEMA水凝胶覆盖的CLSM培养皿中，将包含200ugmL:'F-Doped GQDs和FGQDs的2mLDMEM培养液添加到每个培养皿中，与HepG23DMCs共培弊最佳时间后，用PBS洗涤3次,在洗涤过程中要把培养板静置一会防止吸出HepG23DMCs,并在CLSM下进行细胞显影现象观察。

2.4.4二维细胞显影的定量化分析

将贴壁生长的细胞进行处理后，以每孔10x10*细胞接种于6孔板中，待细胞长到85%汇合后，加入浓度为200ugmL-1F-Doped GQDs和FGQDs的DMEM培养基培养细胞，培养时间与上述细胞显影时间相同。共培养结束后，朋PBS冲洗细胞，然后加入胰蛋白酶溶液进行细胞消化,最后重新分散在PBS中,转移到流式细胞管进行荧光检测，将没有材料的空白细孔设定为阴性对照孔。得到的数据用FlowJo7.6软件进行处理。

2.4.5单线态氧('O2)的检测

电子顺磁共振(EPR)波谱仪用于检测光诱导材料是否产生O2，使用TEMP作为捕获剂，将材料进行不同时间的照射(0,3,6,9,12min)后，在FGQDs的ESR光谱中出现了典型的O2信号峰，并且随著时间的延长，'O2信号峰逐渐增强，可见，FGQDs具有好的光诱导产生'O2的能力。

为了定量分析'O2量子产率，使用化学方法进行检测。水溶性ABDA被用作'O2捕获剂，而RB被用作标准光敏剂。简要地说，将120μuLABDA溶液(2.5mgmLl)添加到400μL样品悬浮液(FGQDs或GQDs-2)中，并使用40mWcm:2的LED灯(400-700nm)作为灯资源。为了消除内部过滤器效应，将RB和测试样品的最大吸收值调整为小于0.2。然后，记录ABDA在不同时间的吸收，以获得PS过程的衰减率。通过下面公式可以计算出样品(Pam)在水溶液中的'O2量子产率:（公式）其中Ksm和KRB分别是被测样品和RB的ABDA分解速率常数，Asam和ARB分别代表被测试样品和RB吸收的光，这是通过积分400-700nm波长范围内的光吸收带而确定的，φRB是RB的'O2最子产率，在水中φRB=0.75。

2.4.6光诱导FGQDs的细胞毒性检测

该实验与"MTT对细胞毒性检测”相同的条件下进行。此外，在添加10μuLMTT之前，将细胞暴露于LED光(400-700nm)12min,然后进行分析。后续步骤与上述步骤相同，实验独立重复三次。

AM-PI对光诱导FGQDs的细胞毒性的评估:将处于对数期生长的HepG2细胞进行处理，以2x10*细胞每孔的密度接种于CLSM中，待细胞长到70%汇合时，用PBS.将细胞冲洗两遍，然后将已经配制好的含有样品的DMEM培养墨覆盖在细胞上，然后放在37°C、5%的CO2的细胞培养箱继续培养，培养结束后，用PBS滴洗细胞，除去没有进入细胞的材料，然后在实验组中进行LED光(400-700nm)照射12min,对照组不.进行光照，光照射结束后，首先在每孔中加入400u[L配好的染色工作液AM覆盖住底部进行活细胞染色，结束后用PBS清洗细胞，洗去多余的AM染料，最后将配好的染色工作液PI以每孔400μuL再加入到培养皿中，避光条件下培养5min,培养结束后，继续用PBS清洗几遍，然后用激发波长为488nm和545nm的通道下进行细胞观察，可以观察到在545nm的通道下仅看到了死细胞。

DCFH-DA对光诱导FGQDs的细胞毒性的评估:具体操作首先将HepG2细胞接种到6孔板中，并在细胞培养箱中进行培养，直至细胞培养板中的细胞接近长到90%，然后将FGQDs和GQDs-2添加到每个孔中共培养6h，然后使用DMEM洗涤3次，并用100μLDCFH-DA染色20min,用高糖DMEM洗涤两次后，离心收集细胞并使用BD流式细胞仪进行观察。

2.4.7光诱导FGQDs对HepG23DMCs的生长抑制作用

将尺寸生长到400-500um范围内的30-40个HepG23DMCs转移到涂有polyHEMA的6孔细胞培养板.上，然后与DMEM、GQDs-2和FGQDs共培养7天。每天在光照下进行光照12min或在黑暗中进行，实验独立重复三次，并且每天记录HepG23DMCs的尺寸大小。

2.4.8动物模型的建立

本操作中用到的小鼠是从安徽医科大学处购买的四周大SPF级Balb.C雌小鼠，在安徽大学生命科学学院进行饲养，当葬到5周时进行肿瘤细胞注射，首先以150x10*每100uL的浓度进行注射HepG2细胞，等待瘤子长到约5cm左右时进行试验操作。把老鼠随机分为三组，一组为FGQDs，一组为GQDs-2，另外一组为PBS组，每组老鼠均分为光照组和黑暗组，光照组每两天进行样品的注射25min后进行LED灯照射15min,然后手机拍照记录肿瘤的大小。

第三章 氟掺杂石墨烯量子点在细胞显影中的应用研究

3.1前言

由于传统的半导体量子点和含亚金属的重金属簇具有出色的荧光特性，因此已在体外和体内进行了大量的生物成像研究，但是与重金属有关的健康危善也阻磚了它们在生物成像中的应用。与此相反，GQDs具有相似的显著荧光特性，并且细胞毒性极低，这使其可以成为用于设计新型生物成像探针的强候选者。荧光GQDs相对于传统的有机荧光发射团和无机半导体量子点而言具有优异的光稳定性、生物相容性、简单且廉价的合成方法、易于表面修饰和可调节的激发和发射性能等明显的优势，这些都使GQDs有望在能量转换、存储设备、催化和生物医学等领域中广泛应用。在GQDs的众多优异性质中，荧光性质的研究最为广泛。因此，通过各种合成方法合成GQDs和杂原子掺杂的GQDs提高GQDs的荧光性质是至关重要的[98]。因此，本章主要研究了一种F-Doped GQDs的合成方法，研究了它的形貌、结构和光学性质，并讨论了其在细胞显影中的应用。

3.2实验部分

F-Doped GQDs和GQDs-1的合成详见“第二章样品制备”。

3.3结果与讨论

3.4本章小结

在本章中，选取GO-1作为前驱体，通过氧化切割法合成得到了F-Doped GQDs和GQDs-1，随后对它们的形貌、结构、光学性质和细胞毒性及细胞显影进行了测试表征，实验结果如下:1、通过TEM测试得到F-Doped GQDs的平均粒径为2.88nm,GQDs-1的平均粒径为2.48nm，它们的晶格间距都符合标准的石墨烯(100)晶面，说明它们都具有石墨烯内核结构，证明F-Doped GQDs和GQDs-1都是二维纳米结构。2、通过PL光谱测试得到F-Doped GQDs和GQDs-1具有非激发光波长依赖性，且它们都表现出稳定且优异的荧光性能，F-Doped GQDs和GQDs-1的QY分别为12.3%和10.4%。3、通过HepG2细胞和HeLa细胞测试了F-Doped GQDs和GQDs-1的细胞毒性，结果显示F-Doped GQDs和GQDs-1既使在很高的浓度(300ugmLl)下，它们都表现出很低的毒性，并且F.Doped GQDs对细胞的毒性相对于对照样品GQDs.1更低。4、使用HepG2细胞和HeLa细胞对F_Doped GQDs和GQDs-1的细胞显影效果进行测试，结果表明F-Doped GQDs和GQDs-1在细胞中都具有明亮的荧光，但是,F-Doped GQDs的显影效果更加明显，可作为细胞荧光显影剂使用。

第四章 氟化石墨烯量子点的生物医用研究

4.1前言

光动力治疗(PDT)是继手术切除、化学疗法和放射疗法之后的一种有效的可用于治疗肿瘤的辅助性临床方法，尤其是在浅表肿瘤的治疗中。PDT作为一种经典方法，已经在临床研究中使用，它需要光敏剂(PS)分子，可见光或近红外光以及生物靶组织中氧分子的存在。PDT也被用于临床治疗多种癌症类型，例如皮肤癌、肝癌、食道癌和早期肺癌等[111,102]，与传统的肿瘤治疗方案相比，PDT的优点是能够进行精确而有效的治疗，与其它公认的治疗方法相比，没有重大副作用，因此可以在较短的时间间隔内进行循环应用。近年来，PDT被认为是与化学疗法或放射疗法结合使用的最有效的辅助治疗程序之一，它还可以保护健康组织，同时增加肿瘤切除的安全性[113,114]。

GQDs是一种与二维石墨烯片有关的新型零维(0D)最子点(QD)。GQDs具有许多优越的性66.51，例如良好的荧光性能、在紫外线或可见光下极好的抗光漂自性以及易于衰面改性等优点，使其广泛适用于如生物标记、生物显像和生物医学疗法，尤其是浅表肿瘤的PDT和特定类型的肿瘤疾病1216.1由于PDT作为治疗方法的使用越来越多，已使用不同的方法使用不同的光敏材料来实现光诱导的'O2高产率。Sun等人(89]报道了氮掺杂GQDs(N.GQDs)，与良好的PS分子相似，它具有改善的亲水性、较低的细胞毒性和出色的光物理性质。更重要的是，在PDT的应朋中，将合成的N-GQDs与玫瑰红(RB)标准PS偶联，在可见(480nm)光照射下对细胞模型可表现出高的细胞毒性作用。众所周知，对GQDs的掺杂作用可以改变最终化合物的光物理性18101811,自此，研究人员致力于杂原子掺杂GQDs的设计与合成，Gong等人1201以氟化石墨为原料，同时采用溶剂热法合成氟化石墨烯量子点，为化学功能化和GQDs的制备提供了新的见解，到目前为止，氟化石墨烯量子点尚未用于PDT或光活化治疗作用。也有人报道了另一项有关氟化GQDs的研究，使用以氟化氧化石墨烯为原料的微波辅助水热法，但是，合成过程很复杂，与以前的合成方法相比，没有明确说明合成路线的好处，更重要的是，报告的氟化GQDs并未作为PDT的PS进行使用或探索。本章工作使用Hummers法合成高产盘lO2的氟化GQDs(FGQDs)。

本章采用的以氟化石墨为起始原料的氧化裂解方法具有以下优点:合成的FGQDs尺寸小、水溶性好、O2产量高，可以更好地应用于PDT中。另外，在有无光照条件下，还进行了体外'O2.产量测定，以证明FGQDs具有产生高'O2的能力。此外，为了评估FGQDs在更多更复杂的多细胞生物系统中具有抑制肿瘤生长的功能，本章工作探讨了FGQDs对三维多细胞球体(HepG23DMCs)的生长抑制作用[121-123]。基于FGQDs在光照射下具有高lO2产量，从而导致对HepG23DMCs的光诱导细胞毒性增强，并具有显薯的生长抑制作用，因此有力地暗示了其有望作为PS的应用。

4.2实验部分

FGQDs和GQDs-2的合成详见“第二章样品制备

4.3结果与讨论

4.4本章小结

在本章中，选取氧化切割FGO为前驱物合成FGQDs，并且对FGQDs的形貌、结构、光学性质、细胞毒性及2D细胞显影和HepG23DMCs显影和体内体外PDT性能进行了一系列测试衰征，实验结果如下:

1、通过TEM测试可以得出FGQDs具有明显的晶格衍射条纹，晶格间距为0.205nm,这表明其具有良好的石墨烯内核结构。

2、通过荧光光谱测试得出FGQDs具有非激发光波长依赖性，并且QY为13.71%。

3、采用MTT法对FGQDs进行细胞毒性测试，结果表明，HepG2细胞具有90%以上的细胞存活率，说明FGQDs具有极低的细胞毒性。

4、使用HepG2细胞与FGQDs共培养以观察细胞显影效果，结果表明，FGQDs在细胞中具有明亮的绿色荧光，可用作细胞显影。而且FGQDs被细胞摄取后从CLSM图中看到荧光只出现在细胞膜和细胞质中，在细胞核中没有观察到荧光现象。

5、测试了LED灯照射下FGQDs的'O2产率，通过UV-Vis光谱得出单线态氧产率达到49%，可以应用在PDT中，并且随着光照时间的延长，与FGQDs样品共培养的.HepG2细胞存活率逐渐降低，可以预期FGQDs具有更高的'O2量子产率，可发展成为非常有前途的用于PDT的新一代PS。

6、选取带有HepG2肿瘤的小鼠对FGQDs的体内PDT效果进行研究，研究发现FGQDs在肿瘤位置具有一定的富集效果，并且随營照射时间增长肿瘤体积逐渐减小。

第五章 结论与展望

本论文合成了GO-1、GO-2、FGO、GQDs-1、GQDs-2、F-Doped GQDs及FGQDs,并对这些材料的形貌、结构以及性能进行了一系列的研究，而且还研究了它们在细胞显.影以及光动力治疗方面的应用，得出以下总结:

1:以石墨为原料合成氧化石墨烯作为前驱物,通过氧化切割法合成F-Doped GQDs:F-Doped GQDs的氟掺杂量为1.21%，平均粒径为2.9nm,具有非激发光依赖性。在含有微量Fet溶液的F-Doped GQDs中的荧光明显减弱。同时，以HepG2细胞与HeLa细胞为模型研究F-Doped GQDs的生物显影应用，首先采朋MTT方法评估F-Doped GQDs的细胞毒性，即使材料的浓度高达300ugmL:!时，两种细胞的细胞存活率仍然达到80%,进而用两种细胞做了细胞显影来观察细胞荧光显影效果,结果显示F-Doped GQDs具有良好的细胞显影鲜果。

2:以含氟石墨为原料合成含氟氧化石壘烯作为前驱物，随后，通过氧化切割法合成FGQDs:FGQDs的氟掺杂量为1.43%，平均粒径为2.1nm，在365nm紫外灯照射下可以发射出明亮的绿色荧光，并且同样具有非激发光波长依赖性，相对荧光量子产率为13.71%。以HepG2细胞为二维细胞模型和三维细胞模型来研究了细胞显影效果，通过CLSM可以观察到在405nm的通道下，具有良好的细胞成像现象。进而利用EPR可以捕捉到FGQDs产生得lO2的信号，通过紫外数据的拟合曲线可以得到'O2QY达到49%。然后通过HepG2细胞为模型研究了细胞毒性,即使FGQDs的浓度达到300ugmLI时，细胞存活率仍然达到了85%，因此FGQDs具有良好的生物相容性。并且在LED灯光照下，细胞的细胞存活率明显降低，同时在HepG23DMCs中，随着光照时间的增长，细胞团的体积逐渐减小。上述现象可以得出FGQDs可以用作细胞显影和光动力治疗功能的光敏剂。

本论文中合成的材料是对GQDs及其掺杂GQDs的大量合成做出了--定的贡献，提高了GQDs的lO:的量子产率，实现了光诱导产生高lO:的能力，在光诱导下对细胞具有一定的毒性作用，并且可以很好地抑制肿瘤体积的增长，进而对GQDs作为PS提供了一定的方向，但是，本工作中也存在或多或少的的不足之处需要解决，例如，如何合成含氟量高的GQDs、如何提高在细胞中的成像效果以及如何达到光动力治疗的最高效果并且可以尽早用到临床医学研究中。

李真真.氟化石墨烯量子点的合成及其在细胞显影和肿瘤光动力治疗中的应用研究[D].安徽大学,2020.

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