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草珊瑚多糖和姜制江香薷多糖组合牙膏的消炎止血作用研究

2025-02-10 128 上传者：管理员

摘要：目的：探究含姜制江香薷多糖以及姜制江香薷多糖和草珊瑚多糖配伍牙膏的消炎止血功效。方法：通过构建大鼠牙龈炎模型，采用牙周探诊检测大鼠牙龈指数、菌斑指数和牙龈出血指数，ELISA法测定大鼠血浆中细胞因子IL-4、IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α含量评价多糖牙膏的抗炎作用；通过脂多糖诱导人牙龈上皮细胞炎症模型,采用CCK-8法选取最佳给药浓度，ELISA法测定细胞上清液中NO、IL-4、IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α含量评价其抗炎作用；通过构建体外血小板模型，测定OD值计算血小板聚集率，ELISA法测定TXB2的含量评价其止血作用。结果：与模型组比较，各牙膏对大鼠口腔出血指数、牙龈指数、菌斑指数水平均显著性减少，且Ⅱ号牙膏样品减少更明显；与模型组比较，各牙膏样品均能使抑炎因子含量增加，促炎因子含量降低，且Ⅱ号牙膏样品在提高抑炎因子IL-4和降低促炎因子IL-1β、TNF-α、NO具有更好的作用；Ⅱ号牙膏组与其他组比较血小板聚集率增高更明显，Ⅰ号牙膏组和Ⅱ号牙膏组与其他组比较TXB2含量增加更明显。结论：6种牙膏样品均具有抗炎作用，其中Ⅱ号牙膏样品（含姜制江香薷多糖和草珊瑚多糖）具有较好的抗炎作用；6种牙膏样品均能使血小板聚集率增高和TXB2含量增多，其中Ⅱ号牙膏样品与其他组有显著差异，具有较好的止血作用。

关键词：
中草药牙膏
多糖
姜制江香薷
消炎止血
配伍
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牙周炎和牙龈炎是常见口腔疾病，可引起牙龈出血、牙龈退缩、牙齿松动等病症，这不仅会影响口腔的咀嚼、发音等生理功能，还与脑卒中、心脏病、糖尿病、消化系统疾病等全身系统疾病密切相关，因此防治牙周炎与牙龈炎极为重要，通过刷牙保持口腔卫生健康是一种非常有效的方法。牙膏具有清洁口腔等基本功能之外，消炎止血作用也是口腔护理的需求之一。江香薷作为江西的道地药材，入药部位为植物的带根全草或地上部分，含有挥发油、黄酮类、多糖等多种活性成分［1］，具有发汗解表、化湿和中之功，用于暑湿感冒、恶寒发热、头痛无汗、腹痛吐泻、水肿、小便不利［2］。江香薷多糖具有抗炎、抗氧化、免疫调节等生物活性［3-4］，研究表明，采用生姜炮制江香薷能扩大其药用范围。草珊瑚全株可入药，含有香豆素类、黄酮类、酚酸类、萜类、挥发油多糖等多种活性成分［5］。药理学研究表明，草珊瑚具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等作用，多应用于清热凉血、活血消斑、祛风通络［6-7］。据相关报道，草珊瑚多糖是草珊瑚中水溶性成分，具有很好的抗炎、抗氧化、抗肿瘤活性［8-9］，草珊瑚也是传统的牙膏添加物，具有一定的口腔护理保健作用。因此，将草珊瑚多糖和姜制江香薷多糖添加进牙膏，是否具有消炎止血作用。

1、材料

1.1仪器

HH.WB22-550-11型水浴锅（上海跃进医疗器械有限公司）；CQ-250A-DST型超声波清洗机（上海跃进医用光学器械厂）；TDZ5-WS型离心机（Cence湘仪公司）；RE5205型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；冷冻干燥机（美国LABCONCO公司）；BS200S-WEI型电子分析天平（北京塞多利斯天平有限公司）；多功能酶标仪（Thermo公司）。

1.2药品与试剂

云南白药牙膏（云南白药集团股份有限公司）；草珊瑚牙膏（南昌诚志股份有限公司）；云南田七中药牙膏（佛山黄岐嘉纯生物工程有限公司）；人牙龈上皮细胞（HGECs，上海富衡生物科技有限公司）；Ⅰ号牙膏样品（含姜制江香薷多糖）、Ⅱ号牙膏样品（含姜制江香薷多糖和草珊瑚多糖）、Ⅲ号牙膏样品（含江香薷水提物）；人牙龈成纤维细胞完全培养基（上海富衡生物科技有限公司）；牙龈卟啉单胞菌脂多糖（赛默飞世尔科技有限公司）。牙膏样品前期处理：分别将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号牙膏及云南白药牙膏、草珊瑚牙膏、云南田七6种中药牙膏样品，水浴浸提，浸提液过滤后离心取上清液后，减压旋蒸至最初牙膏体积，置于真空干燥箱中干燥6 h，再冷冻干燥得到牙膏的供试样品，用DMEM培养基复溶成0.8%、0.4%、0.2%、0.1%、0.05%，0.22μm的滤膜过滤，4℃保存备用。

1.3受试动物

SPF级雄性SD健康大鼠56只，体重（200±20）g，由江西中医药大学实验动物科技中心提供，实验动物合格证编号：SYXK（赣）2022-0002，使用许可证编号：SCXK（赣）2018-0003。所有动物操作符合实验动物伦理要求，并获得江西中医药大学实验动物伦理委员会的审批（伦理编号JZLLSC20230665）。

2、方法

2.1体内外消炎效果研究

2.1.1 大鼠牙龈炎实验

SPF级SD大鼠共64只，雌性，活动良好，无龋坏，无牙周病。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，选择双侧上颌第二磨牙用医用丝线结扎于牙颈部，结扎丝线尽量放入龈沟内，结扎后用10%糖水代替饮水喂养，每隔1天接种1次制备好的菌液0.5 mL，正常对照组为假手术组，麻醉后不用丝线结扎不喂10%糖水。建模成功后，随机分成8组，每组8只，6组分别给6种牙膏试样30 d，模型组和正常对照组（假手术组）只给生理盐水。腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后固定大鼠，探诊出血指数（BOP）、牙龈指数（GI）、菌斑指数（PI），检测大鼠血浆中细胞因子IL-4、IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α含量等。

2.1.2 体外检测抗炎能力

（1）牙膏样品对HGECs细胞毒性的影响。用HGECs专用培养基培养HGECs细胞，当细胞生长至对数期时，调整细胞浓度为1×105个/mL，接种于96孔板中，每孔200 µL，在37℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养。加入浓度梯度的牙膏样品处理，含10 μg/mL脂多糖（LPS），使牙膏样品最终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 µg/mL，每个浓度设置6个复孔，作为给药组；同时用不含药物的饥饿培养基培养，作为对照组；用不含细胞的饥饿培养基培养，作为空白组。培养24 h后，弃去培养液，每孔加入含10% CCK-8的培养基，继续培育2 h后，用酶标仪测量450 nm处各孔的吸光度。（2）牙膏样品对LPS诱导HGECs细胞炎症因子的检测。同方法（1），以LPS诱导HEGCs细胞炎症模型（为LPS诱导的模型组），以正常的牙龈上皮细胞HEGCs为正常对照组，以（1）最适抗炎浓度的牙膏样品给药，收集细胞上清液，检测细胞因子NO、IL-4、IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α含量。

2.2体外止血效果研究

大白兔新鲜血液，离心后将血小板密度调整为1×1012/L，先检测空白时的吸光度OD0，加入不同牙膏样品（5 μL/孔），轻微震荡。再将该96孔板置于37℃下恒温孵育5 min，充分反应。随后加入5 μL二磷酸腺苷（ADP）溶液轻微振荡以诱导血小板聚集，血小板出现聚集反应后，体系内的浊度会发生变化。酶标仪法检测吸光度OD1计算血小板聚集率。按照ELISA试剂盒说明书检测兔血浆中的TXB2含量。血小板聚集率（%）= 00 1ODOD − OD ×100%。

2.3数据处理

数据采用SPSS 26.0软件进行分析，各项指标采用均数±标准差（x s ±）表示。通过单因素方差分析（ANOVA）确定组间均数比较差异，以P<0.05表示差异有统计学意义。

3、结果

3.1大鼠牙龈炎比较与模型组比较，各组牙膏对大鼠口腔BOP、GI、PI水平均显著性减少（P<0.05），且Ⅱ号牙膏样品组比其他组降低更明显（P<0.05）。见图1。

图1对大鼠出血指数、牙龈指数、菌斑指数的影响

与模型组比较，各组牙膏样品均能使抑炎因子含量增加（P<0.05），致炎因子含量下降（P<0.05，P<0.01），且Ⅱ号牙膏样品在提高抗炎因子IL-4、IL-10和降低IL-1β、TNF-α、IL-6具有更好的作用（P<0.05）。见图2、图3。

图2对抑炎因子IL-4、IL-10含量的影响注

图3各牙膏样品对致炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量的影响

3.2对HGECs细胞活性的影响

采用浓度梯度的牙膏样品处理（含10μg/mLLPS）HGECs细胞，筛选干预浓度，CCK-8法检测不同质量浓度牙膏样品对细胞增殖率的影响。通过CCK-8法检测牙膏样品对HGECs细胞增殖和毒性，细胞存活率在80%~100%的牙膏样品浓度为对HGECs最安全也是最适宜的处理浓度，因此，采用0.6μg/mL样品浓度评价各组牙膏样品的抗炎作用最适。见图4。

图4对HGECs细胞增殖和毒性的影响

3.3对LPS诱导HGECs细胞炎症因子表达的影响

各组牙膏样品孵育后的HGECs所分泌细胞因子IL-4、IL-10、NO、IL-1β、IL-6、TNF-α，与模型组比较，各组牙膏样品均能使抑炎因子含量增加（P<0.05，P<0.01），致炎因子含量下降（P<0.05，P<0.01），且Ⅱ号牙膏组在提高抗炎因子IL-4和降低NO、IL-1β、TNF-α 具有更好的作用（P<0.05）。见图5、图6、图7。

图5对LPS诱导孵育后的HGECs所分泌细胞因子IL-4、IL-10含量的影响

图6对LPS诱导孵育后的HGECs所分泌细胞因子NO、IL-1β含量的影响

图7对LPS诱导孵育后的HGECs所分泌细胞因子IL-6、TNF-α含量的影响

3.4对血小板聚集率的影响

血小板聚集率是止血功能的最早反应，血小板聚集率增高时则呈现凝血状态，随着牙膏浓度增加，血小板聚集率增高，且Ⅱ号牙膏样品与其他组比较增高更明显，具有显著性差异（P<0.05）。见图8。注：与Ⅱ号牙膏组比较，*P<0.05。图8对兔血小板生物模型中血小板聚集率的影响血小板分泌TXB2的含量可以反映血小板的活性，TXB2含量越高，表示血小板生理活性越活跃。Ⅱ号牙膏样品在浓度0.1%~0.4%范围内与其他组比较差异显著（P<0.05）；Ⅱ号牙膏样品与Ⅰ号牙膏样品在浓度0.8%时与其他组比较差异显著（P<0.05）。见图9。

图9对兔血小板生物模型中血小板分泌TXB2含量的影响

4、讨论

本研究通过构建体内大鼠牙龈炎模型和体外LPS诱导HGECs细胞炎症模型观察多糖牙膏对其抗炎作用的影响，采用牙周探诊检测大鼠GI、PI、BOP水平，结果显示，与模型组比较，各牙膏对大鼠口腔GI、PI、BOP水平均显著减少，且Ⅱ号牙膏样品减少更明显；采用ELISA法测定大鼠血浆中细胞因子IL-4、IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α 含量和细胞上清液中NO、IL-4、IL-10、IL-6、IL1β、TNF-α 含量。与模型组比较，各牙膏样品均能使抑炎因子含量增加，致炎因子含量下降，且Ⅱ号牙膏样品在提高抗炎因子IL-4和降低IL-1β、TNF-α、NO具有更好的作用；通过构建体外血小板模型，测定OD值计算血小板聚集率，ELISA法测定TXB2的含量，各牙膏样品均能使血小板聚集率增高和TXB2含量增多，其中Ⅱ号牙膏样品与其他组有显著差异，具有较好的止血作用。由此可以看出，多糖牙膏具有较好的消炎止血作用，且姜制江香薷多糖与草珊瑚多糖配伍牙膏的消炎止血作用更为显著，可能是因为2种多糖产生协同作用，增强疗效。

目前国内市场上的中草药牙膏添加的中草药活性成分主要是黄酮类、生物碱类、皂苷类、挥发油类、香豆素类、鞣质类、蒽醌类以及有机酸类等［10-12］。对以多糖为主要成分的口腔护理产品研究较少，目前尚未见到将姜制江香薷多糖用于制备口腔护理产品的相关文献报道。江香薷作为一种药食同源的药材，其安全性高，具有抗菌、杀虫、抗氧化等药理作用［1］。研究表明，生姜炮制江香薷后其多糖含量增加，具有抗炎、抗氧化、免疫调节等生物活性。草珊瑚多糖具有抗炎、抗氧化活性，因此，开发一种以多糖为主要成分并具有消炎止血作用的口腔护理产品具有重要意义。

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