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胆碱对脂多糖诱导的胎儿生长受限大鼠的治疗作用及机制研究

2023-08-24 113 上传者：管理员

摘要：过多的促炎细胞因子会导致不良的妊娠结局，包括子痫前期和胎儿生长受限。抗炎可能是一种有效的疗法。本研究的目的是通过LPS治疗是否会出现胎儿生长受限（FGR），并评估胆碱是否可以抑制脂多糖（LPS）诱导的胎儿生长受限大鼠模型中的胎盘炎症并改善妊娠结局。方法将怀孕的Sprague-Dawley大鼠分为对照组、LPS处理组（LPS）、LPS+胆碱处理组和胆碱处理组（Choline），每组7只。妊娠第14天给予LPS(1μg/kg)建立大鼠模型。胆碱（5.0 g/kg）分别为从GD1到GD20给药，然后在GD20处死大鼠。记录胎儿的丢失，活胎儿的数量和质量以及胎盘的质量。收集胎盘以评估胎盘病理并确定炎性细胞因子和α7nAChR的水平。结果 LPS可加重胎盘病理损伤和增加胎盘炎性细胞因子的水平，降低胎盘α7nAChR水平，并减少活胎的数量并诱发FGR。胆碱治疗增加了胎儿体质量、胎盘质量和活幼崽的数量（P<0.05），减少胎盘炎症反应以及增加了α7nAChR水平。此外，LPS组的胎盘白细胞介素（IL）-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α的升高在胆碱给药后得到明显抑制（P<0.01）。结论胆碱可能通过激活α7nAChR介导的胆碱能抗炎途径来减轻胎盘炎症和改善胎儿结局，这表明胆碱的抗炎作用可能是胎儿生长受限的替代疗法。

关键词：
炎症
胆碱
胆碱能抗炎通路
胎儿生长
胎儿生长受限
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胎儿生长受限（fetal growth restriction,FGR）被定义为体质量小于对应孕龄体质量第10百分位数，影响全球5%～10%的新生儿，增加了围生期的发病率和死亡率[1,2]。FGR新生儿发生缺氧缺血性脑病、脑室出血和坏死性小肠结肠炎的概率更大，住院时间也更长[3]。此外，全球的流行病学、临床和实验研究均强调了不良的宫内环境与远期不良健康结果之间的关联[4,5,6]，特别是出生时体型小与成年后患冠心病、高血压和2型糖尿病的风险之间存在显著关系。目前，早产是FGR的唯一治疗方法，导致医源性发病率和死亡率的进一步升高[7]。

FGR的主要原因不是胎盘结构的异常或遗传缺陷，而是“胎盘功能不全”[8,9,10]。尽管许多环境、营养和激素因素与胎盘功能不全有关，但免疫性炎症也是重要的因素[11,12]。胆碱能抗炎通路（cholinergic anti-inflammatory pathway,CAP）是最近提出的一种免疫调节途径，通过连接神经系统和免疫系统来抑制炎症细胞因子的释放，该途径的关键特征是神经系统（主要是迷走神经或其他非神经系统）的乙酰胆碱与特定的烟碱样受体（α7烟碱乙酰胆碱受体或α7n ACh R）相互作用，抑制炎症因子释放，发挥全身抗炎作用[13,14]。研究显示，α7n ACh R激动剂胆碱可通过抑制促炎性细胞因子的释放在子痫前期孕鼠起抗炎作用，改善临床症状[15]。

我们旨在确定胆碱对α7n ACh R的激活是否可以保护胎儿免受LPS诱导的FGR的侵害。在本研究中，我们使用α7n ACh R激动剂胆碱来干预LPS诱发的胎儿生长受限的大鼠，并通过病理分析和其他定量方法进一步探讨其与胎盘相关的可能机制。

1、材料和方法

1.1实验动物

从海南医学实验动物中心获得了大约6～8周龄（体质量范围：200～240 g）的Sprague-Dawley(SD）大鼠。动物使用规程和此处描述的实验步骤已获得中国海南医科大学动物伦理委员会的批准（批准号[2021]03006），并根据《实验室护理和使用指南》进行了实验动物。选择的实验大鼠在受控的温度（22～24℃），湿度（50%～70%）和光照（12 h∶12 h光照-黑暗周期）的条件下随意喂食普通饲料和水。将雌性大鼠与雄性大鼠交配过夜。交配后阴道涂片上的精子阳性被指定为妊娠的妊娠日（gestational day,GD)0(GD0）。

怀孕大鼠随机分为4组（每组7只）：怀孕对照组（Control）、LPS处理组（LPS）、LPS+胆碱处理组（LPS+Choline）、胆碱处理组（Choline）。怀孕的SD妊娠第14天，将脂多糖（LPS,1μg/kg）溶于2 m L无菌生理盐水，输注速率为2 m L/h，注入大鼠尾静脉诱导FGR模型。LPS+Choline和Choline组在GD1～GD20期间，孕鼠喂胆碱饲料（5.0 g/kg）。对照组大鼠在同时期接受等体积的生理盐水溶液（0.9%Na Cl）。

1.2数据和样品收集

在怀孕第20天，在上午9:00至上午10:00之间用异氟醚麻醉大鼠并颈椎脱臼，以避免激素昼夜节律干扰。取出胎儿和胎盘，记录活胎儿和胎盘的数量和质量。记录活胎数、死胎数、吸收胎数。吸收胎是在胎鼠发育过程中，出现发育障碍以致胚胎被吸收的情况。计算总胎数、活胎率、死胎率、吸收胎率。公式：总胎数=活胎数+吸收胎数+死胎数；活胎率=活胎数/总胎数；死胎率=死胎数/总胎数；吸收胎率=吸收胎数/总胎数。获得不同组的胎盘储存在‒80℃以用于随后的实验。

1.3胎盘组织学检查

胎盘的小部分随机选择并固定在10%福尔马林的0.1 mol/L PBS(p H 7.4）中固定48 h，然后脱水并包埋在石蜡中。用切片机制作3～5μm的纵向切片，安装在载玻片上，用苏木精和曙红（H-E）染色，并用光学显微镜（Leica DM2500，德国，上海仁科生物科技有限公司）观察。

1.4免疫组化方法

3～5μm切片用切片机制成并放置在载玻片上，在二甲苯中脱蜡，在乙醇中冲洗，并通过一系列降低浓度的乙醇放入水中。然后将切片微波用于抗原修复，并用0.3%H2O2预处理。随后，将切片在4℃的加湿室中与山羊血清一起在含有兔抗α7n ACh R抗体（1∶1000稀释）的一抗溶液中孵育过夜。洗涤后，将样品与合适的二抗溶液在室温下孵育1 h。最后，将切片在辣根过氧化物酶-链霉亲和素中室温孵育1 h，并用二氨基联苯胺显色反应。切片用苏木精复染，通过一系列增加乙醇浓度的二甲苯脱水，放置在盖玻片下，然后在光学显微镜下拍照。

1.5 RNA提取和实时q PCR

严格按试剂盒说明，使用TRIzol®试剂（美国Invitrogen公司）从胎盘中提取总RNA，所提总RNA经核酸测定仪测定样品RNA含量和纯度。使用5µg总RNA结合反转录引物和Revert AidTM M-Mu LV反转录酶（美国Thermo公司）进行反转录。随后，使用包含10μL Taq Man®Universal PCR Master Mix[Tli RNase H Plus;Takara Bio.,Shiga,宝生物工程（大连）有限公司]、正向和反向引物各1μL、2μL c DNA模板和7μL超纯水。反应条件为：50℃、2 min,94℃、10 min，然后进行PCR,95℃、15 s,60℃、1 min,40个循环。由上海生物技术有限公司设计的引物序列。α7n ACh R和β-Actin的引物序列如下（分别为正向和反向）：α7n ACh R(5'-ACCTCGTGTGAT CCAAAGCC-3'和5'-GGTTTCCTCTTGCTCAGGGT-3'）和β-Actin(5'-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3'和5'-GT ACTCCTGCTTGCTGATCC-3'）。β-Actin作为内参。通过使用2‒ΔΔCt调整相对m RNA表达。

1.6 Luminex分析

如上所述收集胎盘。通过在800μL RIPA裂解缓冲液中匀浆60 mg胎盘组织来制备总裂解物。使用Luminex200系统和Bioplex HTF（美国Bio-Rad公司）根据制造商的说明书检测不同组的胎盘IL-6、IL-8和TNF-α水平。标准品和每个样品均一式三份进行分析。使用Bio-Plex Manager 5.0版（美国Bio-Rad公司）进行数据分析，并以浓度（pg/m L/mg）表示。

1.7统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件，所有数据均表示为平均值±平均值的标准误（SEM），当P<0.05时，差异具有统计学意义。使用One Way ANOVA检验（LSD-t检验，Dunnett’s T3检验）进行显著性分析，计数资料组间差异性比较采用非参数检验进行显著性分析。所有统计学柱状图均采用Graph Pad Prism6软件作图。

2、结果

2.1胆碱对胎儿结局的影响

LPS和胆碱对各组妊娠结局的影响见表1。母体暴露于LPS显著降低活胎率，增加死胎率、吸收胎率和FGR率，但有趣的是，补充胆碱可显著逆转LPS引起的死胎率、吸收胎率和FGR率升高，并提高活胎率。与对照组相比，单纯胆碱处理（Choline组），活胎率，死胎率、吸收胎率和FGR率无明显变化。

表1各组的妊娠结局

2.2胆碱对胎儿重量、胎盘重量和身长的影响

LPS组的活胎重量比对照组低了10个百分点以上[（3.80±0.24)vs(2.82±0.11)g,P<0.05]，如图1所示。这意味着LPS可显著降低孕妇的活胎质量诱发FGR。胆碱（LPS+Choline组）预处理可显著提高LPS诱导的胎儿体质量[（3.25±0.09)vs(2.82±0.11)g,P<0.05]。Control组和Choline组之间无显著差异（P>0.05）（表1和图2）。与Control组相比，LPS可显著降低胎盘的质量[（0.52±0.02)vs(0.41±0.02)g,P<0.05]。Choline组和Control组之间的胎盘质量没有显著差异（P>0.05），而有趣的是，胆碱处理后显著增加胎盘的质量（图1和图2)[(0.47±0.01)vs(0.41±0.02)g,P<0.05]。4组胎儿身长无显著差异（P>0.05）。

图1胎鼠和胎盘组织

图2各组胎儿质量、胎盘质量和身长

2.3胆碱对胎盘病理的影响

Control组和Choline组的胎盘中未观察到这些病理变化。这些组的胎盘具有正常的胎盘结构（图3A和图3D）。LPS组表现为绒毛发育不良，胎盘绒毛间隙管腔狭窄，细胞滋养层细胞减少，血管壁炎性细胞浸润及纤维素样渗出物等（图3B）。然而，在胆碱预处理组（LPS+Choline组），表现为少许炎性细胞浸润和纤维素样渗出物，未见明显梗死灶。

2.4胆碱对胎盘α7n ACh R的影响

Real-time PCR结果显示，LPS+Choline和Choline组的α7n ACh R m RNA表达显著高于Control组和LPS组（4.90±0.42和5.57±0.37,vs 3.20±0.16和2.90±0.12,P<0.05）。在Control组和LPS组之间没有发现显著差异（3.20±0.16和2.90±0.12,P>0.05）（图4左图）。

免疫组化测定各组胎盘中α7n ACh R蛋白表达的情况，如图4（右图）所示，与Control组和LPS组相比，LPS+Cholihe组和Cholihe组显著升高α7n ACh R的表达水平（P<0.05),Control组和LPS组相比较差异无统计学意义。

2.5胆碱对胎盘炎性细胞因子水平的影响

各组胎盘中细胞因子的水平如图5所示。LPS处理组与Control组相比，胎盘中TNF-α、IL-6和IL-8的水平升高[分别为（8.12±0.26）、（11.19±0.69）、（14.04±0.98)pg/(m L·mg)和（5.41±0.19）、（4.56±0.46）、（8.14±0.68)pg/(m L·mg),P<0.05]。与单独使用LPS相比，使用LPS+Choline治疗可显著降低胎盘TNF-α,IL-6和IL-8水平增加[（6.45±0.16）、（5.39±0.21）、（10.66±0.56)pg/(m L·mg),P<0.05]。有趣的是，Choline组TNF-α[(5.54±0.36)pg/(m L·mg)]、IL-6[(4.00±0.19)pg/(m L·mg)]和IL-8[(7.14±0.37)pg/(m L·mg)]水平和对照组之间无显著差异（P均>0.05）。

图3各组妊娠大鼠胎盘结构的变化（GD20)

3、讨论

在当前的研究中，我们发现胆碱可显著改善妊娠结局，并增加了胎儿和胎盘的体质量，减轻胎盘病理损伤。此外，胆碱还增加了胎盘α7n ACh R的表达并有效抑制胎盘中的炎症细胞因子水平。

在本研究中，对怀孕的Sprague-Dawley大鼠进行尾静脉注射LPS，可显著降低存活胎儿的质量，诱发FGR，并伴有死胎和吸收胎数量的增加和活胎的数量减少。与之前的研究结果相似。胆碱处理后了可显著增加胎儿质量，同时减少胎儿丢失并增加活胎儿的数量。这些数据证明了胆碱对LPS诱导的FGR的保护作用。

胎盘在整个怀孕期间对于维持胎儿生长至关重要。胎盘结构和功能受损是胎儿生长异常的重要因素，包括流产、FGR和其他并发症[16,17,18]。通过研究了不同组胎盘的质量和组织形态学特征。我们发现在LPS处理的大鼠中发现胎盘质量减少，伴有明显的胎盘病理变化。胎盘的病理变化包括毛细血管发育不良的绒毛和蜕膜中炎性细胞的浸润以及绒毛间间隙中细小血管的减少。这些降低的有效绒毛表面积和减少的绒毛末梢毛细血管数量，影响从母亲到胎儿的正常营养和氧气供应[19]。

图4各组胎盘α7n ACh R m RNA和蛋白的表达情况

图5各组胎盘细胞因子的表达情况

之前的研究表明LPS治疗在动物模型中产生炎症反应，这与细胞因子水平升高有关[20,21,22]。用α7n ACh R激动剂处理鼠巨噬细胞系，如尼古丁、PNU282987、GTS-21和胆碱，导致促炎细胞因子受到抑制[23,24,25,26]。有学者发现，胆碱可减少LPS诱导的细胞因子增加并逆转LPS诱导的大鼠症状。结合本研究结果，LPS激活了母体的炎症反应，增加了胎盘中炎性细胞因子，破坏了胎盘的结构和功能，使胎儿的氧气和营养供应不足，最终导致FGR。

研究表明迷走神经通过CAP在病程中对免疫与炎症具有迅速而有效的调节作用，而α7n ACh R在CAP中起着至关重要的作用[27]。在人和大鼠胎盘中均观察到了α7n ACh R的表达[28]。本研究表明，胆碱可增加LPS诱导的胎盘α7n ACh R的表达，降低胎盘中炎性细胞因子。我们推测，胆碱作为α7n ACh R激动剂，激活胆碱能抗炎途径，抑制炎症细胞因子的释放，减轻炎性反应刺激所致疾病的严重程度，逆转了LPS对胎盘的伤害，进而保护胎儿免受LPS的影响。这与其他研究一致，这些研究也证明了胆碱或其他激动剂对促进胎儿生长的作用[29,30]。但是，需要进一步的基础研究来确定此类治疗的安全性和有效性以及我们假设的真实性。

总而言之，我们的研究表明，胆碱可能通过减轻胎盘炎症，帮助保护妊娠晚期大鼠免受LPS诱导的FGR。进一步的研究将有助于探索用α7n ACh R激动剂或某些针对FGR的细胞因子进行治疗的潜在策略。

文章来源:黄丽莉,夏可辉.胆碱对脂多糖诱导的胎儿生长受限大鼠的治疗作用及机制研究[J].中国优生与遗传杂志,2023,31(08):1533-1538.