针灸作为一种有效的镇痛方法在临床上应用广泛[1,2]。针刺镇痛效应通常被认为是疼痛部位和针刺穴位所产生的不同感觉传入在外周和中枢相互作用的结果[3,4]。穴位局部不同感觉神经传入纤维的激活可以直接影响镇痛效应[5],而用利多卡因阻断穴位局部神经传入可显著降低针刺镇痛效应[6]。在影响针刺效应的诸多因素中,针刺强度、频率和针刺部位的参数组合对镇痛效应起到了关键作用[7]。在电针刺激频率与电针效应方面,韩济生等[8,9,10]观察到低频和高频电针刺激分别通过影响脑啡肽和强啡肽的释放产生镇痛效应,而其他参数的镇痛效应尚缺乏研究。

与电针频率和部位相比,临床医生则更注重针刺手法,强调刺激的强度、深度与临床疗效的关系。《素问·刺要论》中有“病有浮沉,刺有浅深”的记载,且针刺皮、肉、筋、骨、脉等不同层次的刺激都和疗效相关。对于同一疾病,相同穴位予以不同深度、不同强度的针刺,疗效也有差异,而比较电针不同深度及不同刺激强度疗效的实验研究还未见报道。本研究采用完全弗氏佐剂造成肌肉炎性痛,以C纤维反射确定大鼠A纤维和C纤维的阈值以区分刺激强度,通过观察不同强度的电针和经皮穴位电刺激(transcutaneouselectricalacupointstimulation,TEAS)对肌肉炎性痛大鼠行为学的影响和自发肌电的抑制效应,探讨刺激穴位不同层次及结构激活不同传入神经纤维在针刺镇痛中的作用,为临床针刺深度与强度的规范化提供实验依据。

1、材料与方法

1.1实验动物及分组

健康SPF级雄性SD大鼠48只,体质量(200±10)g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,生产许可证号:SCXK(京)2016-0002。采用随机数字表法将大鼠随机分为正常组、模型组、Ta强度TEAS(TEAS-Ta)组、Tc强度TEAS(TEAS-Tc)组、Ta强度电针(EA-Ta)组、Tc强度电针(EA-Tc)组,每组8只。实验开始前于中国中医科学院针灸研究所动物房(清洁级)适应性饲养1周,实验全程给予12h/12h光暗周期限制,大鼠自由饮水及摄食,维持室温23～25℃,相对湿度50%～70%。实验过程严格遵循中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》以及中国中医科学院针灸研究所2005年发布的《实验室管理条例》。

1.2主要试剂与仪器

完全弗氏佐剂(completeFreund’sadjuvant,CFA,美国Sigma),异氟烷(河北一品制药股份有限公司),小动物麻醉机、小动物双足平衡仪(瑞沃德生命科技有限公司),一次性使用针灸针(北京中研太和医疗器械有限公司),韩氏电针仪(南京济生医疗科技有限公司),生物电放大器(英国Digtimer),Powerlab信号采集分析系统、Powerlab刺激器(澳大利亚AD)。

1.3造模方法

异氟烷吸入麻醉状态下,在大鼠右侧膝关节外上股二头肌肌肉丰厚处注射CFA200μL/只,使用双足平衡仪测定动物站立时双侧后肢在压力传感器上的受力情况。正常大鼠双足的体质量分配基本相同,当CFA肌肉注射后,造模侧的体质量分配明显降低,故双足的体质量分配差值可用来反映疼痛的情况。本研究以双足承重差值大于15g为造模成功的标准。

1.4干预方法

穴位定位参照《实验针灸学》[11],取右侧“梁丘”(后肢膝关节外上约5mm)。电针组使用0.18mm×13mm毫针,TEAS组使用医用胶布将自制的经皮电刺激电极固定于穴位表面。在异氟烷吸入麻醉下进行干预,刺激频率为2Hz/100Hz,波宽1ms,每次30min,1次/d,共3d,正常组和模型组予以相同时间的麻醉。

TEAS和电针干预的强度通过C纤维反射实验来确定。具体方法如下:将大鼠麻醉后俯卧位放在实验台上,暴露股二头肌,局部剃毛,皮肤常规消毒。将刺激电极插入大鼠后肢第4、5趾之间,将记录电极插入股二头肌;使用刺激器给予电刺激,强度从0.5mA开始,递增幅度为0.2mA,每组刺激中包含了刺激频率为0.2Hz、波宽为1ms的6个刺激。使用Labchart电生理信号处理分析系统及放大器记录屈肌反射的肌电图。在股二头肌记录的屈肌反射肌电包含两个成分:第1个成分是由Aδ纤维激活介导的,其特征为潜伏期短,持续时间短,阈值较低;第2个成分是由C纤维激活介导的,其特征为潜伏期长,持续时间长和阈值较高[12]。通过给予不同强度的电刺激,观察可诱发Aδ纤维和C纤维肌电成分的最低刺激强度。本研究中观察到大鼠屈肌反射的反射弧长度为(16.3±0.63)cm,Aδ纤维和C纤维肌电成分的潜伏期分别为(13.54±1.96)ms和(144.78±25.5)ms。经计算得出Aδ纤维和C纤维的传导速度分别为(12.21±1.46)m/s和(1.14±0.19)m/s,符合A纤维和C纤维传导速度的范围。根据以上实验结果确定TEAS和电针干预的强度,其中激活A纤维的阈值为(0.96±0.09)mA,激活C纤维的阈值为(3.63±0.24)mA。

1.5观察指标及检测方法

大鼠双足承重差值的测量:分别于造模前、造模后第3天及干预后1、2、3d用双足平衡仪测定各组大鼠站立时双侧后肢在压力传感器上的受力情况。控制面板上连续采集大鼠10s内的左、右后肢负重的平均值,每侧采集5次,以健侧肢体的受力值减去患侧肢体的受力值,得出相应的双足负重差值,取均值。

大鼠异常肌电的曲线下面积、放电频率、曲线下面积抑制率和放电频率抑制率的检测:在异氟烷麻醉状态下,暴露股二头肌,局部剃毛,皮肤常规消毒。将记录电极插入股二头肌记录肌电图。使用Labchart电生理信号处理分析系统及放大器进行记录,并将结果导入spike2生理数据采集分析系统进行数字化处理,得出电针或TEAS“梁丘”前后1min异常肌电的曲线下面积和放电频率,并计算干预前后曲线下面积和放电频率的抑制率,计算方法为:曲线下面积抑制率=[(干预前曲线下面积-干预后曲线下面积)/干预前曲线下面积]×100%,放电频率抑制率=[(干预前放电频率-干预后放电频率)/干预前放电频率]×100%。对比电针或TEAS“梁丘”前后1min内肌肉炎性痛大鼠异常肌电的曲线下面积、放电频率、曲线下面积抑制率和放电频率抑制率的差异。

1.6统计学处理

使用SPSS17.0统计软件进行数据处理,所有数据均为计量资料,以均数±标准差(x±s)表示,数据符合正态分布且方差齐,行为学数据用重复测量的方差分析,其他数据用单因素方差分析,进一步两两比较用LSD检验,组内干预前后异常肌电的比较用配对样本t检验。以P≤0.05为差异有统计学意义的标准。

2、结果

2.1各组大鼠疼痛行为学比较

造模前,各组大鼠双足承重差值比较,差异无统计学意义(P>0.05);造模后与正常组比较,其余各组大鼠双足承重差值显著升高(P<0.01),提示大鼠出现肌肉痛,造模成功。干预后与模型组比较,TEAS-Tc组、EA-Ta组、EA-Tc组双足承重差值显著降低(P<0.05,P<0.01),TEAS-Ta组差异无统计学意义(P>0.05)。干预后3d,TEAS-Tc组双足承重差值低于TEAS-Ta组(P<0.05),EA-Ta组与EA-Tc组比较差异无统计学意义(P>0.05)。不同层次的最优参数TEAS-Tc和EA-Ta组双足承重差值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1各组大鼠双足承重差值的比较

2.2各组大鼠异常肌电的曲线下面积及曲线下面积抑制率比较

与本组干预前比较,TEAS-Ta组大鼠干预后异常肌电的曲线下面积差异无统计学意义(P>0.05),TEAS-Tc组、EA-Ta组显著降低(P<0.01,P<0.05),EA-Tc组显著升高(P<0.05)。与TEAS-Ta组比较,TEAS-Tc组异常肌电的曲线下面积抑制率显著升高(P<0.05)。与EA-Tc组比较,EA-Ta组异常肌电的曲线下面积抑制率显著升高(P<0.01)。不同层次干预的最优刺激参数TEAS-Tc组与EA-Ta组异常肌电的曲线下面积及曲线下面积抑制率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2各组大鼠异常肌电曲线下面积及曲线下面积抑制率的比较

2.3各组大鼠异常肌电的放电频率及放电频率抑制率的比较

与本组干预前比较,TEAS-Ta组干预后异常肌电的放电频率差异无统计学意义(P>0.05),TEAS-Tc组、EA-Ta组干预后显著降低(P<0.01,P<0.05),EA-Tc组干预后显著升高(P<0.05)。干预后与TEAS-Ta组比较,TEAS-Tc组异常肌电的放电频率抑制率显著升高(P<0.05);与EA-Tc组比较,EA-Ta组异常肌电的放电频率抑制率显著升高(P<0.01)。不同层次干预的最优刺激参数TEAS-Tc组与EA-Ta组比较,大鼠异常肌电的放电频率抑制率差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

3、讨论

大鼠双侧承重的不对等分布被认为是伤害性感觉测量的指标,并已广泛应用于多种疼痛模型的检测[13,14]13-14]。深部组织损伤、局部注射炎性刺激物时可引起局部疼痛和炎性反应,具体表现为静息状态下肌肉局部自发放电增多[15,16]15-16]。本研究在前期观察到,正常大鼠股二头肌未出现自发放电,造模后4～8d股二头肌肌电活动显著增加,“梁丘”不同层次的干预对异常肌电的曲线下面积和放电频率均产生了不同的影响。本研究结果表明:TEAS-Tc、EA-Ta和EA-Tc刺激“梁丘”均可缩小肌肉炎性痛模型大鼠的双足承重差值,TEAS-Tc和EA-Ta还能抑制肌肉炎性痛部位异常肌电活动,提示在不同层次需要激活不同的传入神经纤维才能发挥对肌肉炎性痛的镇痛作用。本实验中观察到虽然EA-Tc刺激“梁丘”可改善肌肉炎性痛模型大鼠的痛行为,但是却增加了局部异常肌电活动,这可能是因为EA-Tc是伤害性刺激,刺激后即刻引起了伤害性肌电的发放增加,而行为学测定是在针刺结束后4h进行,此时观察到的明显的镇痛作用可能是由于高强度的电针引起了中枢的下行性抑制,产生了全身广泛性的镇痛效应。

国外研究[17]17]表明,真针刺和假针刺镇痛都有效,均优于常规治疗,但是真假针刺的效果差异不大,因此得出针刺相当于安慰剂治疗效果的结论。有研究[18]18]对39个临床试验的2万多例病例进行Meta分析,结果表明针刺治疗的效应量相对于不刺入对照可达到0.5SDs,而与刺入的假针刺对照其效应量下降到0.2SDs,说明浅刺的假针刺有一定疗效,针刺的临床疗效和对照密切相关。此外,痛阈低的患者采用假针刺(浅刺)的效果好,痛阈高的患者采用深刺的效果好[19]19]。这些研究提示,浅刺作为假针刺对照,并不是无效的安慰针刺。从本研究的结果来看,TEAS达到激活A类神经纤维的刺激强度没有明显的镇痛效果,证明了采用TEAS激活A类神经纤维的强度可以作为安慰对照;而达到激活C类神经纤维的强度后,确实有一定的镇痛效果,只要是刺入的都不是没有治疗作用的安慰效应,因此在针刺治疗痛症方面,选择局部浅刺作为安慰对照是不合理的。

TEAS和电针是临床常用的对不同层次进行干预的镇痛手段[20,21]20-21],但其产生效应的传入机制是不同的。基于经典的闸门控制理论,较早的研究观察到高频低强度的TEAS兴奋了有髓鞘的A类神经纤维,在脊髓水平抑制了伤害性信息的传入,起到了局部镇痛作用[22,23]22-23]。高强度的TEAS则兴奋了皮下C类传入神经纤维,可能激活了中枢下行抑制系统产生镇痛效应[24]24]。也有研究[25,26]25-26]表明TEAS的镇痛效应与强度密切相关,等于或低于感觉阈值的刺激是无效的。近期研究[14]14]观察到在痛源部位使用对皮肤具有较强刺激性的辣椒贴激活了皮肤区C纤维传入,从而抑制了伤害性感觉传入并减少了深层肌肉部位炎性因子的释放,说明激活皮肤C类传入神经纤维对深层肌肉炎性痛具有较好的局部镇痛效应。本研究结果证明TEAS通过激活皮下C类传入神经纤维可以抑制肌肉疼痛,这当然也可能是由于伤害性刺激引起上位中枢的下行抑制来发挥作用。此外,研究还表明在局部蛇毒破坏A类神经纤维髓鞘后导致C类神经纤维对伤害性感觉的传入增加,并引起局部的神经源性炎性反应,而补充A类神经纤维刺激则可抑制C类神经纤维对伤害性感觉的传入,减少神经源性炎性渗出,说明局部存在着A类神经纤维对C类神经纤维的抑制闸门,这个闸门控制在外周就可以完成[27]27]。本研究证明采用激活A类神经纤维的强度刺激到达肌肉层,可以很好地缓解肌肉炎性痛模型大鼠炎性反应侧的肌肉疼痛,这可能和启动局部的闸门有关。

图3各组大鼠异常肌电放电频率及放电频率抑制率的比较

以往的研究非常关注针刺强度和镇痛效果,闸门学说很好地解释了脊髓背角A类传入神经纤维通过中间神经元抑制了伤害性C类神经纤维的感觉传入,这给针刺镇痛提供了很好的理论基础。但是这一解释并没有对穴位的神经传入做深入探讨。本研究选取“梁丘”,经解剖定位后观察到该穴位于大鼠后肢臀浅肌上,肌肉丰厚,深部结缔组织下有坐骨神经走行,这可能是本研究中针刺产生局部效应的结构基础。综上所述,本研究结果表明在痛源部位不同层次,需要采用不同强度的刺激激活不同的神经纤维发挥镇痛作用。在肌肉炎性痛局部若采用Ta强度的TEAS可能会由于刺激强度太低而无法产生明显的镇痛效应,而采用Tc强度的电针则可能会由于刺激强度太高而引起不适感,甚至难以忍受。因此,在临床应用中采用Tc强度的TEAS(激活皮肤的C纤维传入)和Ta强度的电针(激活肌肉的A纤维的传入)可能更合理。临床中医生注意深浅刺激和强度的结合,为疼痛机制的研究提供了很好的思路,同时本实验结果也为临床针刺镇痛的应用提供了科学依据。

参考文献：

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