偏头痛是一种常见的、复杂的、伴有感觉改变的致残性神经系统疾病。近年来,国内多项多中心临床随机对照试验[1,2]已证实,针刺预防偏头痛发作疗效确切。Cochrane系统评价[3]表明针刺预防偏头痛发作的疗效等同于甚至优于药物预防。近40年来,三叉神经血管系统激活被认为是偏头痛发作的中心环节[4]。白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)/环氧化酶2(cyclooxygenase-2,COX2)/前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)炎性反应通路与TVS激活密切相关[5,6,7,8]。前期研究[6]发现电针预处理显著下调偏头痛大鼠三叉神经节IL-1β/COX2/PGE2炎性反应通路相关分子的表达,但对IL-1β/COX2/PGE2炎性反应通路上游调控机制尚不清楚。Andersen等[9]发现偏头痛患者非发作期血清miR-34a-5p水平与正常人无差异,而偏头痛发作时血清中miR-34a-5p表达显著上调,而沉默信息调节因子1(silentmatingtypeinformationregulation2homolog-1,SIRT1)可以通过调控核因子κB亚基p65(nuclearfactorkappaBp65subunit,NF-κBp65)乙酰化参与IL-1β转录[10]。本研究以偏头痛模型大鼠为研究对象,通过观察大鼠三叉神经节miR-34a-5p、SIRT1及NF-κBp65表达,进一步探讨电针预防偏头痛发作的分子机制。

1、材料与方法

1.1实验动物及分组

健康雄性SPF级SpragueDawley大鼠50只,体质量220～250g,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,动物使用许可证号:SYXK(湘)2019-0004。饲养温度为(22±2)℃,相对湿度为(50±10)%,光暗周期为12h,大鼠自由摄食、饮水。适应性喂养1周后,将大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、电针组、电针+EX527组,每组10只。本研究经西南医科大学伦理委员会批准,实验过程中对动物的处理严格遵循2006年中华人民共和国科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》[11]。

1.2主要试剂和仪器

SIRT1、乙酰化NF-κBp65(NF-κBAc-p65)、IL-1β抗体(英国Abcam公司),NF-κBp65、COX2、β-actin抗体及二抗(美国Proteintech公司),PGE2、降钙素基因相关肽(calcitoningene-relatedpeptide,CGRP)酶联免疫吸附检测(ELISA)试剂盒(武汉华美生物工程有限公司),SIRT1抑制剂EX527(美国Selleck公司),mRNA反转录试剂盒、miRNA反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(北京康为世纪公司),Trizol、蛋白Marker(美国Thermo公司),RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、SDS凝胶配制试剂盒及Westernblot一抗、二抗稀释液(上海碧云天生物技术有限公司),10%水合氯醛(中国Wellbio公司)。0.25mm×25mm环球牌毫针(苏州医疗用品厂有限公司),HANS-200A型电针治疗仪(南京济生医疗科技有限公司),MB-530型多功能酶标分析仪、PW-812全自动酶标洗板机(深圳市汇松科技发展有限公司),DYY-6C型电泳仪、DYCZ-40D型转膜仪(北京市六一仪器厂),JJ224BC型电子天平(美国双杰公司),PIKOREAL96型荧光定量RCP仪(美国Thermo公司),ZS-FD/S大小鼠数显脑立体定位仪(北京众实迪创科技发展有限责任公司),QuantityOne图像分析软件(美国Bio-Rad)。

1.3造模方法

动物术前禁食12h,自由进水。以10%水合氯醛腹腔注射(0.35mL/100g)麻醉后,将大鼠固定在脑立体定位仪上,门齿固定插设在正中处,常规消毒备皮,头顶正中“十”字形切开皮肤,暴露双侧顶骨,在前囟后移3.2～3.4mm、旁开2.8～3.23mm处,用0.8mm钻径牙钻钻孔,孔径约为5倍钻径,避免损伤大鼠脑组织,深度以钻头穿过颅骨但不损伤脑膜为准,且边钻孔边用无菌棉球蘸以预冷的4℃0.9%氯化钠溶液冷却钻头及颅骨。然后采用电生理程控刺激仪将电极针垂直插入右侧三叉神经节,深度为硬脑膜下9.2mm,电刺激参数为5Hz、5ms、0.6mA,持续时间为10min。对侧只插微电极不刺激。用0.9%氯化钠溶液浸过的纱布覆盖颅骨,以防失水干燥。室温维持在25℃左右。所有操作均在无菌条件下进行[6]。

1.4干预方法

正常组:正常喂养,不做任何处理。

假手术组:仅在电刺激部位用牙钻打孔,电极插入10min但不进行电刺激。

模型组:依据1.3造模方法电刺激三叉神经节建立偏头痛大鼠模型。

电针组:造模前,将大鼠固定后,取大鼠右侧“风池”“外关”,用0.25mm×25mm的毫针直刺2.0～3.0mm。针刺操作完成后,针柄接电针治疗仪,频率2Hz/15Hz,电流强度1mA,以肌肉出现轻微抖动为度。每天治疗1次,每次治疗20min,连续治疗5d。第6天开始造模,其余处理同模型组。

电针+EX527组:造模前,大鼠腹腔注射EX527(5mg/kg,SIRT1抑制剂)[12],每天1次,连续5d,其余操作同电针组。

1.5观察指标及检测方法

模型成功的标准:电刺激时可见刺激侧(右侧)咀嚼肌收缩,口鼻分泌物增多,提示刺激部位在右侧三叉神经节,而电刺激三叉神经节是公认的偏头痛实验动物模型,提示造模成功[13]。

ELISA法测定大鼠血清PGE2和CGRP浓度:于造模后1d,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,快速心尖取血5mL,室温放置2h后于2～8℃1000×g离心15min,留取上清。依据PGE2和CGRPELISA检测试剂盒使用说明书操作,使用酶标仪(波长450nm)读取吸光度值,根据标准曲线得出的公式计算PGE2和CGRP的含量。

荧光定量PCR法检测三叉神经节miR-34a-5p、SIRT1和IL-1βmRNA的表达:心尖取血后,每组取5只大鼠断头处死,于冰上迅速分离出大鼠右侧三叉神经节,放入液氮中速冻。取组织约20mg,用Trizol法提取总RNA,紫外分光光度计下检测总RNA浓度和纯度,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。在miRNA3’末端加多聚A尾使miRNA具有Poly(A)尾(25μL反应体系:37℃,孵育15min),之后再使用Oligo(dT)通用反转录引物进行反转录,合成miRNAcDNA第一链。以组织总RNA为模板,反转录为cDNA。分别以miRNAcDNA和cDNA为模板进行PCR扩增反应,扩增条件:预变性95℃10min;变性95℃15s,退火/延伸60℃1min,40个循环。反应结束后,PCR仪给出各个反应孔的Ct值。miR-34a-5p以U6为内参,SIRT1和IL-1β以β-actin为内参,用2-ΔΔCt法计算各样品的miR-34a-5p及SIRT1、IL-1βmRNA相对表达量。PCR引物均由上海生工生物工程有限公司合成,引物序列见表1。

表1PCR引物序列

Westernblot法检测大鼠三叉神经节SIRT1、IL-1β、NF-κBp65、NF-κBAc-p65和COX2的蛋白表达:心尖取血后,每组取5只大鼠断头处死,于冰上迅速分离出大鼠右侧三叉神经节,放入冷冻管在液氮中速冻。取组织约20mg,用冰预冷PBS清洗组织,加入200μLRIPA裂解液于生物样品均质仪中反复研磨组织直至看不见组织块;冰上裂解10min;4℃,12000r/min离心15min;将离心后的上清转移到1.5mL的离心管中。取160μL蛋白上清,加入40μL5×loadingbuffer混匀,沸水煮5min,-20℃保存备用。BCA法测定蛋白浓度。配制分离胶,蛋白上样、电泳、电转,裁取含目的条带和内参β-actin条带的PVDF膜,将膜浸入PBST稀释的5%脱脂奶粉,室温放置60min,4℃过夜,次日室温放置30min,PBST漂洗(5min×3次),将膜与一抗(SIRT11∶1000、IL-1β1∶1000、NF-κBp651∶2000、NF-κBAc-p651∶400、COX21∶500和β-actin1∶5000)室温孵育90min,PBST漂洗(15min×3次),加入二抗室温孵育90min,PBST漂洗(10min×3次),使用ECL化学发光液与膜孵育1min,用滤纸吸尽液体,用塑封膜将膜包裹,在暗盒内与X线片曝光15～30min,显影冲洗。将曝光后的底片扫描,并用QuantityOne专业灰度分析软件分析目的条带的吸光度值,以目的蛋白与内参蛋白吸光度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.6统计学方法

采用SPSS18.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,所有资料均进行方差齐性检验,符合正态分布且方差齐时,组间比较采用单因素方差分析,两组之间比较用LSD法,方差不齐时用TamhaneT2法进行两两比较。以P≤0.05为差异有统计学意义的标准。

2、结果

2.1各组大鼠行为学观察

电刺激三叉神经节建立大鼠偏头痛模型时,大鼠建模侧咀嚼肌均出现明显收缩,口鼻分泌物增多,说明电刺激部位为三叉神经节。与正常组和假手术组比较,造模后1d,模型组、电针组和电针+EX527组大鼠前肢频繁搔头、刺激侧咀嚼肌收缩,有时可见口鼻分泌物增加。电针组大鼠前肢搔头次数少于模型组和电针+EX527组。

2.2各组大鼠血清PGE2和CGRP浓度比较

正常组与假手术组大鼠血清CGRP和PGE2浓度差异无统计学意义(P>0.05)。与正常组、假手术组比较,模型组大鼠血清PGE2和CGRP浓度显著升高(P<0.05)。与模型组比较,电针组大鼠血清PGE2和CGRP浓度显著降低(P<0.05)。与电针组比较,电针+EX527组大鼠血清PGE2和CGRP浓度升高(P<0.05)。见图1。

图1各组大鼠血清PGE2和CGRP浓度比较

2.3各组大鼠三叉神经节miR-34a-5p表达比较

正常组与假手术组大鼠三叉神经节miR-34a-5p表达差异无统计学意义(P>0.05)。与正常组、假手术组比较,模型组miR-34a-5p表达显著上调(P<0.05)。与模型组比较,电针组大鼠三叉神经节miR-34a-5p表达显著减少(P<0.05)。与电针组比较,电针+EX527组miR-34a-5p表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2各组大鼠三叉神经节miR-34a-5p相对表达量比较

2.4各组大鼠三叉神经节SIRT1、IL-1βmRNA表达比较

正常组与假手术组大鼠SIRT1和IL-1βmRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。与正常组、假手术组比较,模型组SIRT1mRNA显著降低(P<0.05),IL-1βmRNA表达显著升高(P<0.05)。与模型组比较,电针组SIRT1mRNA显著升高(P<0.05),IL-1βmRNA显著降低(P<0.05)。与电针组比较,电针+EX527组SIRT1mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05),IL-1βmRNA表达显著升高(P<0.05)。见图3。

图3各组大鼠三叉神经节SIRT1、IL-1βmRNA相对表达量比较

2.5各组大鼠三叉神经节SIRT1、IL-1β、NF-κBp65、NF-κBAc-p65和COX2蛋白表达比较

与假手术组比较,正常组大鼠三叉神经节SIRT1、IL-1β、NF-κBp65、NF-κBAc-p65和COX2蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)。与正常组、假手术组比较,模型组SIRT1蛋白表达显著降低(P<0.05),IL-1β、NF-κBp65、NF-κBAc-p65和COX2蛋白表达显著升高(P<0.05)。与模型组比较,电针组SIRT1表达显著升高(P<0.05),IL-1β、NF-κBp65、NF-κBAc-p65和COX2蛋白表达显著降低(P<0.05)。与电针组比较,电针+EX527组SIRT1蛋白表达显著降低(P<0.05),IL-1β、NF-κBp65、NF-κBAc-p65和COX2表达增加(P<0.05)。见图4。

3、讨论

三叉神经血管学说是目前较为公认的偏头痛发病机制学说之一。电刺激三叉神经节能较好地模拟三叉神经血管机制导致的偏头痛,是目前得到认可的一种偏头痛实验动物模型[13,14]13-14]。CGRP释放入血是TVS激活的重要环节[4]4]。本研究中偏头痛大鼠血清CGRP浓度升高提示TVS激活。由于偏头痛属于少阳经典型病证,因此,循少阳经取穴治疗偏头痛是针灸临床实践的常用方法。既往临床研究[15]15]证实电针少阳经穴对急性期偏头痛具有肯定的即时镇痛效应,与电针非经非穴比较镇痛作用更强且持久。因此,本研究取“风池”“外关”进行电针预处理干预,进一步探讨电针预防偏头痛发作的分子机制。

有研究[16]16]显示炎性疼痛的超敏状态与中枢神经系统IL-1β介导的COX-2表达上调及PGE2合成增加有关。三叉神经节离体培养研究证实IL-1β可以诱导三叉神经节COX-2表达,促进PGE2合成释放,进而诱导三叉神经末梢释放CGRP[5]5]。本研究结果再次证实偏头痛大鼠三叉神经节IL-1β/COX2炎性反应信号通路高表达,血清PGE2和CGRP浓度均显著升高,而经电针预处理后,偏头痛大鼠三叉神经节IL-1β/COX2炎性反应信号下调,血清PGE2和CGRP浓度均下降。偏头痛大鼠血清PGE2浓度升高可能与IL-1β/COX2炎性反应信号上调有关。体外研究[8,17]8,17]显示,PGE2可以诱导神经元释放CGRP。本研究表明,IL-1β/COX2/PGE2炎性反应通路可能涉及偏头痛大鼠TVS激活过程中CGRP的释放,而电针预处理可以抑制三叉神经节IL-1β/COX2炎性反应信号,减少PGE2合成和释放,抑制CGRP的释放。

NF-κB是重要的炎性反应转录因子,其亚单位p65乙酰化水平与IL-1β转录水平正相关[18,19]18-19]。本研究发现偏头痛大鼠三叉神经节NF-κBAc-p65蛋白表达增加,IL-1βmRNA表达上调,提示偏头痛大鼠三叉神经节IL-1β转录水平升高可能与NF-κBAc-p65蛋白表达增加有关。SIRT1通过使NF-κBp65亚基去乙酰化,降低其乙酰化水平,从而抑制下游基因的转录表达[20]20]。本研究发现偏头痛大鼠三叉神经节SIRT1表达水平降低,提示NF-κBAc-p65蛋白增加可能与SIRT1去乙酰化能力降低有关。本研究表明电针预处理组偏头痛大鼠SIRT1表达上调,NF-κBAc-p65蛋白水平降低。在其他疾病的动物模型研究中也发现电针可以调节中枢神经SIRT1表达,如电针可以上调高脂饮食诱导胰岛素抵抗大鼠下丘脑弓状核中SIRT1表达[21]21],也可以上调加速衰老小鼠海马中的SIRT1表达[22]22]。本研究显示SIRT1抑制剂EX527可以拮抗电针预处理的抗炎效应,提示电针可通过上调三叉神经节SIRT1抑制炎性反应信号通路。

图4各组大鼠三叉神经节SIRT1、IL-1β、NF-κBp65、NF-κBAc-p65和COX2蛋白相对表达量比较

miRNAs是一组内源性小非编码分子,在基因转录后表达调控过程中起关键作用。目前已经发现一些miRNAs与慢性疼痛的发生和发展有关。有研究[23]23]表明,miRNAs在偏头痛及其缓解中起作用,这些分子被认为是潜在的偏头痛生物标志物。2016年的一项临床队列研究[9]9]结果显示偏头痛发作期病人血清中miR-34a-5p水平显著升高。Gallelli等[24]24]发现,无先兆偏头痛年轻患者血清和唾液中miR-34a-5p和miR-375水平显著高于健康年轻人,经药物治疗后偏头痛患者血清和唾液中miR-34a-5p水平显著降低。本研究显示偏头痛大鼠三叉神经节miR-34a-5p高表达,而电针可以调节与疼痛相关的中枢神经系统miR-34a表达,本研究中经过电针预处理干预的偏头痛大鼠三叉神经节miR-34a-5p表达显著降低,与前期研究[25]25]一致。

在一些疾病发病过程中,miR-34a/SIRT1是重要信号传导通路,miR-34a通过直接抑制SIRT1表达发挥重要作用[26,27,28]26-28]。这些病理过程涉及血管平滑肌细胞钙化[26]26]、内皮细胞衰老[27]27]和炎性疼痛[28]28]等。本研究提示miR-34a-5p/SIRT1也可能是偏头痛发病的重要信号传导通路,通过抑制miR-34a-5p可能促进三叉神经节SIRT1表达,降低乙酰化NF-κBp65(NF-κBAc-p65)水平,减少IL-1β转录,抑制IL-1β/COX2/PGE2炎性反应信号通路表达。电针预处理下调大鼠三叉神经节miR-34a-5p表达,增加SIRT1表达。调控miR-34a-5p/SIRT1信号通路可能是电针预防偏头痛发作的机制之一。

综上,电针预防偏头痛发作的效应可能与抑制偏头痛大鼠三叉神经节miR-34a-5p表达,增加SIRT1表达,降低NF-κBAc-p65蛋白水平,下调IL-1β/COX2炎性反应信号,减少PGE2合成释放,进而减少三叉神经末梢释放CGRP,从而抑制TVS激活有关。

参考文献：

[11]中华人民共和国科学技术部.关于发布《关于善待实验动物的指导性意见》的通知(国科发财字[2006]398号)[J].畜牧兽医科技信息,2007,1(4):35-36.

[13]宋慧荣,任小巧,罗亚敏,等.实验性偏头痛动物模型的应用评价与中医药治疗探讨[J].世界科学技术-中医药现代化,2018,20(1):73-77.

[14]谢娜,李美艺,张颜波,等.偏头痛实验动物模型研究进展[J].中华神经医学杂志,2012,11(2):208-210.

[15]张慧,胡幼平,吴佳,等.电针少阳经穴对急性偏头痛即时镇痛作用时效规律研究[J].中国针灸,2015,35(2):127-131.

[25]陈双懂,顾益枭,徐丹兵,等.电针对神经病理性疼痛小鼠皮层miR-34a的影响[J].针刺研究,2019,44(9):632-636.

张慧,何胜东,纵单单,张雪梅,罗婧,郑佳坤.电针对偏头痛大鼠三叉神经节miR-34a-5p/SIRT1通路的影响[J].针刺研究,2020,45(11):868-874.