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河蚌多糖水提取物对多种恶性肿瘤细胞增殖和迁移的影响

2024-10-03 84 上传者：管理员

摘要：目的探讨河蚌多糖水提取物体外抗肿瘤活性。方法通过离心、浓缩和冷冻干燥的方法制备出可溶性的河蚌多糖水提物，分别采用CCK-8实验、细胞划痕实验和Transwell迁移实验检测河蚌多糖水提取物对肝癌细胞Hep3B、恶性黑色素瘤细胞A375和肺癌细胞PC9增殖、迁移能力的抑制作用。结果 CCK-8实验表明，河蚌多糖水提取物具有时间-浓度依赖性抑制上述3种恶性肿瘤细胞的增殖；划痕实验和Transwell迁移实验结果表明，与对照组相比，河蚌多糖水提取物能够有效抑制上述3种恶性肿瘤细胞的迁移(P均<0.05)。结论河蚌多糖水提取物可以有效抑制多种恶性肿瘤细胞增殖和迁移，为其后续开发和应用提供一定的参考价值。

关键词：
增殖
恶性黑色素瘤
河蚌多糖水提取物
肝癌
肺癌
迁移
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根据2022年中国最新癌症报告显示，肺癌的发病率和死亡率位居癌症首位[1],吸烟、肺部慢性病以及环境污染都是导致肺癌高发的原因[2],免疫疗法治疗肺癌已经取得了显著的临床效果，但由于肺癌的异质性和复杂性，患者难以被治愈。肝癌在肿瘤发病率和死亡率中排名前五，因其发病隐匿，早期未能进行手术切除而使病情逐渐恶化[3],靶向疗法虽能有效控制肺癌恶化，但长时间使用靶向药物出现耐药性[4]。恶性黑色瘤起源于皮肤和其他器官黑素细胞，目前并没有治疗恶性黑色素瘤的特效药。现阶段研究者基于分子层面寻找抑制黑色素瘤生长和转移相关机制[5],希望能够发现新的靶点对抗黑色素瘤。

河蚌又名河歪、河蛤蜊，属软体动物门、真瓣鳃目、蚌科。河蚌富含蛋白质、脂肪、维生素等，对人体有保健功效。早期研究报道，河蚌的主要有效成分之一是河蚌多糖(MP)[6],预实验中，我们发现，河蚌多糖的上清液对肿瘤细胞有一定的抑制作用，但因其溶解性差，无法定量进行相关的细胞实验。

冷冻干燥技术是指将含水物料冷冻到冰点以下，使水变成冰，然后在高真空下将冰转化为水蒸气而除去的方法。该方法可有效保持成分的生物活性、保持样品的性状和结构、延长样品的保存期限并使成品有较好的外观，同时提高样品的溶解度[7]。本实验借助此方法，将河蚌多糖粉末溶解于水中，充分混匀收集上清液后通过冷冻干燥的方法制备出河蚌多糖的水提取物，并进一步从细胞层面探讨河蚌多糖水提取物对肝癌细胞(Hep3B)、恶性黑色素瘤细胞(A375)和肺癌细胞(PC9)的增殖和迁移的影响，为河蚌多糖水提取物抗肿瘤的研究提供一定的参考价值。

1、材料与方法

1.1实验材料

肝癌细胞Hep3B、恶性黑色素瘤细胞A375和肺癌细胞PC9购自武汉普诺赛生命科技有限公司，河蚌多糖粉末购自浙江华圣生物药业有限公司。DMEM培养基购自美国Gibco公司，RPMI-1640培养基购自上海源培生物科技股份有限公司，PBS、0.25%胰酶、CCK-8试剂盒、4%多聚甲醛购自碧云天生物技术有限公司，Transwell小室板购自美国康宁Corning公司。

1.2方法

1.2.1河蚌多糖水提取物的制备

首先将河蚌多糖粉末溶于ddH2O中，通过反复多次离心(10 000rpm, 5min)取上清液收集至玻璃瓶，然后转入烧瓶中，置于旋转蒸发仪进行浓缩，温度为50℃左右。最后通过冷冻干燥的方法把浓缩的河蚌多糖制成可溶性的河蚌多糖粉末。实验时称取所需的克重，加入培养基后使其溶解，过0.22μm滤膜，置4℃冰箱备用。

1.2.2细胞培养

将细胞冻存管从液氮中取出，放置37℃水浴锅中解冻，离心后放置37℃、含有5%的CO2温箱中培养。24h后更换培养基，当细胞覆盖率达到80%～90%,则需要进行细胞传代，弃掉原有培养基，用PBS清洗2～3次后加入含0.25%的胰酶进行消化(不同细胞消化时间不同),传代至所需培养皿中进行实验。实验重复3次。

1.2.3 CCK-8细胞增殖检测

取对数生长期细胞，以每孔8×103个细胞接种于96孔板中，放置培养箱中过夜后加药。用10、20、30、40、50mg/mL的河蚌多糖水提取物处理细胞，只加培养基的设为空白对照组，每个浓度重复3个孔，37℃孵育24h和48h后分别加入CCK-8试剂，使用酶标仪在450nm波长处测定吸光值。只加入CCK-8试剂孔设为阴性对照组。细胞活力(%)=(A药物-A阴)/(A空-A阴)×100%。

1.2.4划痕愈合检测

取对数生长期细胞，以每孔1×106个细胞接种于6孔板中。待细胞贴壁后划痕，加入不同浓度(0、10、20mg/mL)的河蚌多糖水提取物，未加河蚌多糖水提取物的细胞为对照组，37℃孵育48h后显微镜下拍照。细胞迁移率(%)=(0h划痕面积-48h划痕面积)/0h划痕面积×100%。

1.2.5 Transwell迁移检测

将细胞消化后用无血清的培养基制成单细胞悬液，以每孔2×105个细胞接种于Transwell上室，下室加入不同浓度(0、10、20mg/mL)的河蚌多糖水提取物，37℃孵育48h。取出小室，用棉签擦掉小室内细胞和培养基，弃下室的培养基并加入4%的多聚甲醛室温固定30min,加入600μL 0.1%的结晶紫溶液室温染色10min,用PBS清洗干净后晾干，显微镜下观察并拍照。使用Image J软件统计细胞迁移穿过聚碳酸酯膜的细胞数。

1.3统计学方法

本实验数据使用GraphPad Prism 8.0进行统计学分析。不同实验组的数据用表示，对比采用one-way analysis of variance(ANOVA)分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1河蚌多糖水提取物抑制肝癌、肺癌以及黑色素瘤细胞的增殖

如图1所示，河蚌多糖水提取物对肝癌细胞Hep3B、恶性黑色素瘤细胞A375及肺癌细胞PC9均具有明显的抑制作用，且随给药浓度的增加，抑制作用增强。如表1所示，当处理时间增加到48h后，其IC50值分别为15.34、12.00和19.04mg/mL。上述结果表明，河蚌多糖水提取物以浓度-时间依赖性的抑制Hep3B、PC9以及A375细胞的增殖。

图1河蚌多糖水提取物抑制肝癌、恶性黑色素瘤以及肺癌细胞的增殖

A.河蚌多糖水提取物处理三种肿瘤细胞(肝癌细胞Hep3B、恶性黑色素瘤细胞A375及肺癌细胞PC9)24h后CCK-8增殖实验结果；B.河蚌多糖水提取物处理三种肿瘤细胞(肝癌细胞Hep3B、恶性黑色素瘤细胞A375及肺癌细胞PC9)48h后CCK-8增殖实验结果；与对照组(0mg/mL)相比，***P<0.001,n=3。

表1河蚌多糖水提取物处理3种肿瘤细胞不同时间下的IC50值(mg/mL)

2.2河蚌多糖水提取物抑制肝癌、肺癌以及恶性黑色素瘤细胞的横向迁移

如图2所示，不同浓度的河蚌多糖水提取物作用于各组肿瘤细胞48h后，与对照组相比，河蚌多糖水提取物均能够显著抑制3种细胞的迁移。对肝癌Hep3B细胞，当河蚌多糖水提取物浓度增加到20mg/mL时呈现明显的迁移抑制作用；对黑色素瘤A375细胞及肺癌PC9细胞，当河蚌多糖水提取物浓度增加到10mg/mL时均呈现明显的迁移抑制作用，证实了河蚌多糖水提取物对3种肿瘤细胞迁移显著的浓度依赖性抑制。

图2河蚌多糖水提取物抑制肝癌、肺癌以及恶性黑色素瘤细胞的横向迁移

2.3河蚌多糖水提取物抑制肝癌、肺癌以及恶性黑色素瘤细胞的纵向迁移

如图3所示，随着河蚌多糖水提取物浓度的增加，细胞聚集的密度逐渐降低，呈分散状态。与对照组相比，当河蚌多糖水提取物浓度增加到10mg/mL以上时呈现明显的迁移抑制作用(P<0.01)。

图3河蚌多糖水提取物抑制肝癌、肺癌以及恶性黑色素瘤细胞的纵向迁移

3、讨论

近年来，河蚌多糖因其抗肿瘤效果好、安全性高受到人们广泛关注。有研究[8]发现，口服河蚌糖蛋白脂质体可以有效抑制小鼠Lewis肺癌、小鼠黑色素瘤B16细胞的生长，并且与化疗药相比，其抑癌效果显著。口服河蚌多糖对小鼠腹水瘤细胞S180、肝癌细胞H22具有明显的抑制作用，未见明显毒性反应[9]。还有研究[10-11]发现，河蚌多糖可以抑制新生血管生成，诱导肿瘤细胞发生凋亡。我们采用冷冻干燥法提高河蚌多糖的溶解度及利用率，最大限度地保留了河蚌多糖的生物活性，这也是本文的创新点，并且首次对河蚌多糖水提取物开展相关细胞实验。众所周知，肿瘤细胞的无限增殖性、高度转移性是癌症发生发展的关键，本实验首先从增殖和迁移两个方面探究河蚌多糖水提取物对肝癌细胞Hep3B、恶性黑色素瘤细胞A375和肺癌细胞PC9 3种肿瘤细胞的影响。CCK-8实验表明，尽管河蚌多糖水提取物对3种肿瘤的抑制作用比较明显，但是值得注意的是，在24h低浓度(10mg/mL)条件下，河蚌多糖水提取物对3种肿瘤细胞并无抑制作用，河蚌多糖在加工处理过程中发生降解，失去了部分生物活性，推测可能与浓缩时的温度、干燥后水分去除使得药物结构的改变有关。我们根据计算出的IC50值确定后续实验中的给药浓度、时间，发现河蚌多糖水提取物孵育3种肿瘤细胞48h后抑制作用更强，其半数抑制浓度在12～19mg/mL,于是我们选择给药浓度为10、20mg/mL、作用时间延长到48h开展后续实验。另外，划痕实验和Transwell实验结果均表明，河蚌多糖水提取物能够有效抑制肿瘤细胞的迁移，揭示了河蚌多糖水提取物在控制癌症转移方面的潜力。

纵观有关河蚌多糖的研究，我们也发现了一些问题和需要进一步探索的方向。首先，由于目前没有规范检测河蚌多糖含量的行业标准，并且因为河蚌多糖的收集地点、方式以及提取的工艺不同，使得河蚌多糖的获取不稳定。因此，规范河蚌多糖提取、含量测定以及分离纯化并使其标准化亟需解决。其次，虽然本实验制备的河蚌多糖水提取物能够抑制肿瘤细胞的生长，但我们并没有从中提取出可以抑制肿瘤细胞生长的单体。再次，划痕实验和Transwell迁移实验均验证了河蚌多糖水提取物对癌细胞的抑制作用，细胞迁移与上皮间质转化有着密不可分的联系[12],可以通过蛋白免疫印记监测迁移相关蛋白(如E-cadherin、N-cadherin)表达水平。通过高通量测序监测给药前后差异基因的表达，进一步探究其分子机制。最后，虽然先前有研究发现河蚌多糖体内能够抑制小鼠肿瘤细胞生长，但是河蚌多糖水提取物对体内的抑瘤效果及安全性未能得到评估，其具体的药理作用尚不明确。

综上所述，河蚌多糖水提取物能够抑制肝癌细胞Hep3B、恶性黑色素瘤细胞A375和肺癌细胞PC9的增殖和迁移，这提示河蚌多糖水提取物可能成为潜在抗癌药物之一。在未来的研究中我们将继续探究河蚌多糖水提取物的体内、体外抑瘤效果及相关机制。

参考文献:

[1]张思玮.国家癌症中心-我国肺癌死亡人数居所有癌种首位[N].中国科学报,2022-03-24(003)

[3]刘险.免疫检查点到个体化治疗策略的肺癌免疫治疗临床现状与进展[J].中国医学创新,2024,21(7):179

[5]陈攀,李彦,王佳慧,等.PTPRO通过减少STAT3磷酸化抑制黑色素瘤的恶性行为[J].湖北科技学院学报(医学版),2024,38(2):127

[8]胡水根,严惠芳,王奕军,等.圆背角无齿蚌有效组分脂质体抗小鼠肿瘤实验研究[J].中国海洋药物,2003(4):23

[9]罗宇慧,彭蕴茹,叶其正.河蚌多糖抗肿瘤实验研究[J].江苏中医药,2007(10):72

基金资助:浙江省湖州市科技局重点项目(2021GZ52); 湖州市科技特派员项目(2021KT07);

文章来源:何泓一,赵子越,李炎坤,等.河蚌多糖水提取物对多种恶性肿瘤细胞增殖和迁移的影响[J].湖北科技学院学报(医学版),2024,38(05):380-383.