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IREB2在顺铂诱导肺癌细胞铁死亡中的作用分析

2025-06-20 66 上传者：管理员

摘要：目的探讨IREB2在顺铂诱导肺癌细胞铁死亡中的作用｡方法培养人非小细胞肺癌细胞株A549､NCI-H358､NCI-H460､Calu-1､人结肠癌细胞株HCT116和人胚胎肾脏表皮细胞H293T,使用化疗药物(顺铂､5-FU､紫杉醇､多柔比星)处理后比较细胞活力,并比较A549和H293T中IREB2表达水平｡采用siRNA沉默IREB2,分析顺铂处理对转染siRNA的A549细胞活力,同时检测铁死亡通路相关蛋白表达情况｡结果与添加铁死亡抑制剂比较,单纯顺铂处理A549和HCT116细胞株细胞活力更低(P<0.05);相较于H293T,A549中IREB2的mRNA､蛋白表达水平下降(P<0.05),而顺铂处理后IREB2表达水平恢复;与siRNA-Neg相比,siRNA-1转染A549细胞的mRNA和蛋白表达水平明显下降(P<0.05);siRNA+顺铂处理的细胞活力明显高于空载+顺铂和siRNA-Neg+顺铂(P<0.05);IREB2沉默时铁死亡相关蛋白TFRC､OTUD1表达下降｡结论沉默铁死亡的基因IREB2通过控制铁转运和去泛素化进程调节铁负荷,从而介入顺铂诱导的肺癌细胞铁死亡过程｡IREB2可作为顺铂治疗肺癌的全新靶点,以增强化疗治疗效果｡

关键词：
IREB2
临床研究
肺癌
铁死亡
顺铂
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肺癌是最常见的恶性肿瘤之一[1⁃2]｡尽管近年来临床研究取得了较大进展,但肺癌仍是主要死亡原因之一[1⁃2],其中2018年全球统计数据显示,男性肺癌发病率和死亡率均居恶性肿瘤的第一位;女性人群中数据也不容乐观,肺癌发病率､死亡率均位列前三[1⁃4]｡铁死亡(ferroptosis)是一种非凋亡细胞死亡方式,以铁依赖性脂质过氧化为特征[5⁃6]｡铁死亡与多种疾病有关,包括癌症和缺血⁃再灌注损伤等[7⁃8]｡最近的临床前证据表明,靶向铁死亡途径是治疗肺癌的潜在策略[9⁃10]｡铁反应元件结合蛋白2 ( iron responsive ele⁃ment protein 2,IREB2)是一种肺部疾病易感基因,通过调节铁代谢相关蛋白的翻译来促进癌细胞的铁死亡[11⁃12]｡既往研究证实IREB2与肺癌直接相关,但目前暂未有详尽的机制相关研究,也未确定IREB2及其相关的铁死亡在肺癌的调节机制和网络｡因此本研究观察IREB2在顺铂诱导肺癌细胞铁死亡中的作用,拟为肺癌治疗提供一个新靶点和思路｡

1、资料与方法

1. 1材料与试剂

人非小细胞肺癌细胞株A549､NCI⁃H358､NCI⁃H460､Calu⁃1､人结肠癌细胞株HCT116和人胚胎肾脏表皮细胞H293T均来源于中科院上海细胞库｡RP⁃MI1640培养基､胰蛋白酶(胰酶)､转染试剂( Lipo⁃fectamine RNAiMAX)购于赛默飞公司(美国),Gibco胎牛血清购于invitrogen公司(美国),MTT､RNA和总蛋白提取试剂盒购于上海碧云天生物技术公司,铁死亡抑制剂ferrostatin⁃1 ( Fer⁃1)､铁离子螯合剂去铁胺(deferoxamine)购于MCE公司(美国),蛋白marker､Anti⁃IREB2抗体､Anti⁃TFRC抗体､Anti⁃OTUD1抗体和ECL显色液购于Proteintech公司(美国)｡

1. 2细胞复苏与培养

从液氮罐中取出冻存管,置于37℃水浴融化,离心后弃上清,加入RPMI1640培养基(含10%胎牛血清)吹打混匀后置于37℃､5% CO2培养箱中培养｡对于需要传代的细胞,弃旧培养基后使用无菌PBS清洗3次,加入胰酶消化后重新加入培养基,置于37℃､5% CO2培养箱中培养｡

1. 3细胞计数

将所测细胞培养基取出,吹打混匀待用｡使用细胞计数板,吸取适量混匀的细胞悬液沿盖玻片滴入,保证其充满盖玻片和计数板的空隙｡将计数板置于显微镜下,记下四个角大格中细胞数量,悬液细胞数量/ ml =四个角大格细胞数量/ 4 × 104｡

1. 4 MTT细胞活力测定

收集对数生长期细胞悬液并计数,调整细胞密度至5 × 104/ ml,加入100 μl至96孔板,置于37℃､5%CO2培养箱中培养,直至单层铺满孔底｡加入浓度梯度的药物,继续培养至设定的时间点｡在96孔板中加入MTT溶液(0. 5%或5 mg / ml),放回培养箱孵育4 h｡除去培养基后PBS清洗3次,每孔加入150 μl的DM⁃SO,摇床低速震荡10 min｡使用酶标仪在490 nm处检测吸光度｡细胞活力分数= A实验组/ A对照组× 100%｡

1. 5 IREB2沉默

按比例将siRNA和Lipofectamine RNAiMAX混合制成转染混合液｡将准备好的细胞与转染混合液在室温下混匀,置于37℃､5% CO2培养箱中培养6 h后弃培养基,再加入新鲜的完全培养基100 μl｡上述步骤完成后24 h进行药物干预,再24 h后提取RNA及总蛋白进行PCR和WB分析｡引物和IREB2 siRNA序列见表1｡

表1引物和IREB2 siRNA序列

1. 6蛋白表达和mRNA水平分析

先使用总蛋白提取试剂盒､RNA提取试剂盒获取样本,然后使用WB和RT⁃PCR方法检测靶标的表达情况｡所以试剂均来源于试剂盒,所有操作按说明书上步骤｡

1. 7统计学分析

应用统计学软件Graph Prism 9. 0进行数据分析,计量数据均进行正态分布性检验,符合正态分布数据以平均数±标准差表示,两两比较采用LSD⁃t检验分析｡如无特殊说明,显著性水准α = 0. 05,所有P值均表示双侧概率｡

2、结果

2. 1顺铂是诱导肺癌细胞铁死亡首选药物

使用顺铂(5 μg / ml)､5⁃Fu (20 μg / ml)､紫杉醇(10 μmol / ml)､多柔比星(10 μg / ml)处理人非小细胞肺癌细胞株A549､NCI⁃H358､NCI⁃H460､Calu⁃1和人结肠癌细胞株HCT116｡将处理后细胞分为两份,其中一份加入铁死亡抑制剂(A组),另一份不处理(B组),再将单纯给予铁死亡抑制剂的作为对照,均使用MTT法测定细胞活力｡MTT细胞活力测定(以生理盐水处理的细胞活力为100. 00% ),结果显示,相较于单纯铁死亡抑制剂处理,单纯顺铂､5⁃Fu､紫杉醇和多柔比星处理(B组)后肿瘤细胞的细胞活力明显降低;与添加铁死亡抑制剂(A组)比较,单纯顺铂处理A549和HCT116细胞株(B组)细胞活力更低(P < 0. 05)｡这些结果提示,顺铂可以诱导肿瘤细胞发生铁死亡,见表2｡

表2不同化疗药物对肿瘤细胞活力的影响

2. 2 A549中IREB2水平下降

将人非小细胞肺癌细胞株A549(A组)和人胚胎肾脏表皮细胞H293T(B组)培养至对数期,再使用生理盐水或者顺铂处理,提取RNA和总蛋白进行PCR､WB分析｡结果显示,相较于H293T,A549中IREB2的mRNA､蛋白表达水平下降(P < 0. 05),而顺铂处理后IREB2表达水平恢复｡这些结果说明,肺癌细胞中IREB2水平下降,见图1｡

图1 H293T和A549中IREB2表达水平比较

2. 3转染siRNA后IREB2 mRNA和蛋白的表达水平下降

PCR结果显示,表达siRNA⁃Neg A549细胞株的IREB2 mRNA相对表达量为(100. 00 ± 0. 05),而表达siRNA⁃1和siRNA⁃2 A549细胞株的IREB2 mRNA相对表达量分别为(27. 97 ± 0. 89)和(32. 08 ± 0. 72)｡这说明与随机序列siRNA⁃Neg相比,转染siRNA⁃1和siRNA⁃2后IREB2 mRNA表达水平明显降低｡

选择沉默效率更高的siRNA⁃1进行蛋白表达水平验证,WB结果显示,与siRNA⁃Neg相比,siRNA⁃1转染A549细胞的蛋白表达水平明显下降｡这些结果说明,siRNA⁃1可有效沉默IREB2,见图2｡

图2转染siRNA后IREB2蛋白表达水平

2. 4沉默A549细胞中IREB2表达

对顺铂抑制其生长的影响将空载(对照)､siRNA⁃Neg､siRNA⁃1转染A549细胞,24 h后分别加入相同体积的顺铂(5 μg / ml)或生理盐水处理48 h｡MTT细胞活力检测结果显示,siR⁃NA +顺铂处理的细胞活力明显强于空载+顺铂和siRNA⁃Neg +顺铂(P < 0. 05),这些结果说明,IREB2沉默有效减少了顺铂诱导的A549细胞死亡,见表3｡

2. 5 IREB2相关通路蛋白在IREB2沉默细胞中表达水平

使用IREB2和TFRC siRNA转染A549细胞,提取总蛋白后,分析IREB2及铁死亡相关蛋白转铁蛋白受体1(transferrin receptor protein 1,TFRC)､去泛素化酶OTD结构域蛋白1 (OTU domain⁃containing protein 1,OTUD1)表达情况｡IREB2沉默时铁死亡相关蛋白TFRC､OTUD1表达下降｡这提示,IREB2可能在铁转运､铁死亡去泛素化中发挥调控作用,见图3｡

表3顺铂处理对转染siRNA的A549细胞活力影响

图3 IREB2和TFRC沉默对相关蛋白的影响

3、讨论

顺铂已被临床使用治疗多种癌症,其具有良好的诱导细胞凋亡的作用[13⁃14]｡近期报道显示,顺铂具有诱导铁死亡的能力[15⁃16]｡本研究选择常用化疗药物进行比较,结果显示,相较于5⁃FU､紫杉醇和多柔比星等常用药物,顺铂可诱导人非小细胞肺癌细胞活力降低,且这种抑制作用可被铁死亡抑制剂(Fer⁃1)部分逆转,这一结果证实顺铂可诱导肺癌细胞铁死亡｡

此前全基因组关联( genome⁃wide association,GWA)分析表明,15q25(IREB2)和4q22(FAM13A)是肺部疾病的两个显著易感基因[17]｡Yohan等[18]进一步证实,IREB2变体增加了肺癌的可能性｡细胞摄取铁需要铁转运蛋白帮助｡IREB2作为铁反应元件结合蛋白,还被证实参与铁吸收､转运和储存等多种功能的调节[17,19⁃20]｡本研究观察肺癌细胞中IREB2表达水平发现,相较于人胚胎肾脏表皮细胞H293T,肺癌细胞A549中IREB2的mRNA､蛋白表达水平均下降明显,而顺铂处理后IREB2表达水平恢复｡这些结果说明,肺癌细胞中IREB2水平下降｡

铁死亡主要由脂质过氧化驱动,并在多个水平上受到调节,包括谷胱甘肽(GSH)依赖性和非依赖性抗氧化途径､脂质过氧化的生物学相关性以及复杂的铁代谢[21]｡不同的信号通路(如KRAS､TP53､NFE2L2､YAP和LSH通路)经常相互串扰,从而建立复杂的调控网络循环来调节铁死亡[22]｡既然IREB2在肺癌细胞中表达发生变化,本研究进一步分析了其沉默是否影响肺癌细胞活力｡结果显示,IREB2沉默有效减少了顺铂诱导的A549细胞死亡｡这也说明IREB2参与顺铂诱导的肺癌细胞铁死亡｡下一步,本研究初步探讨了这一关键基因如何参与这一调节过程｡

IREB2可编码两种与转运铁蛋白受体结合的铁调节蛋白表达｡转运铁蛋白受体TFRC在细胞中普遍表达,包含铁反应原件,非活化状态呈发夹结构以抑制转录[23]｡IREB2编码的铁调节蛋白的表达可稳定TFRC的mRNA,提升其在膜表面的表达水平,促进细胞摄入铁｡相反的是,IREB2沉默降低TFRC mRNA稳定性,因而铁摄取受阻｡铁死亡不仅以脂质过氧化为特征,也受去泛素化调节｡OTUD1作为去泛素化酶可阻断IREB2降解,进而促进TFRC稳定性和铁摄取[24⁃25]｡本研究沉默IREB2不仅可观察到细胞活力部分恢复,还可发现TFRC､OTUD1表达下降｡这提示,IREB2在铁转运､铁死亡相关去泛素化中发挥调控作用,与此前研究思路一致｡还可以推测,沉默铁死亡的基因IREB2通过控制铁转运和去泛素化进程介入顺铂诱导的肺癌细胞铁死亡过程｡详细来说,IREB2的沉默通过关闭铁摄取和去泛素化过程阻碍铁死亡进程从而促进肺癌细胞的活力/生长｡反之,正常表达的IREB2很可能通过调节铁代谢相关蛋白的翻译来促进癌细胞的铁死亡｡因此,在临床治疗中,可参考将IREB2可作为顺铂治疗肺癌的全新靶点,以增强化疗治疗效果｡

综上所述,顺铂对肺癌细胞A549的生长抑制作用可通过铁死亡抑制剂部分逆转;靶向沉默IREB2可明显减少顺铂诱导的A549细胞的死亡,并降低铁死亡相关蛋白的表达｡因此,IREB2通过控制铁转运和去泛素化进程调节铁负荷,从而介入顺铂诱导的肺癌细胞铁死亡过程｡IREB2可作为顺铂治疗肺癌的全新靶点,以增强化疗治疗效果｡

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基金资助:河南省科技攻关(社会发展)项目(编号:202102310118);

文章来源:卢晏民,曹文霞,陈青青,等.IREB2在顺铂诱导肺癌细胞铁死亡中的作用分析[J].实用癌症杂志,2025,40(06):871-875.