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千层纸素A对卵巢癌细胞的抗肿瘤作用机制

2025-04-15 51 上传者：管理员

摘要：目的研究千层纸素A对卵巢癌细胞生长及凋亡的作用机制，同时评估其对于A2780型卵巢癌细胞增殖的具体影响，旨在为卵巢癌的临床治疗开辟新的路径。方法采用CCK8技术来分析不同剂量下千层纸素A对A2780细胞系增殖活性的影响。通过克隆形成测试来观察千层纸素A在各种浓度条件下对该类细胞克隆能力的作用。利用划痕愈合试验考察千层纸素A对细胞迁移性的调控作用。运用Transwell法检验千层纸素A抑制细胞侵袭力的效果。借助流式细胞仪测量千层纸素A处理后A2780细胞凋亡率的变化情况。结果千层纸素A能够显著降低A2780细胞的增殖速度，并对其克隆形成效率产生负面影响，根据流式细胞术的数据，发现该化合物还能有效限制A2780细胞的迁移活动，Transwell实验进一步证实了千层纸素A具有较强的抑制肿瘤细胞侵袭性功能。结论千层纸素A展现出了良好的抑制卵巢癌细胞增殖、迁移以及侵袭特性的潜力。

关键词：
凋亡
千层纸素A
卵巢癌
增殖迁移
抗肿瘤
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卵巢癌是一种源自卵巢或输卵管的恶性肿瘤类型，位列妇科三大常见恶性肿瘤之一，并且是导致此类癌症死亡的主要因素[1]。在所有妇科恶性肿瘤中，卵巢癌的致死率最高。大多数情况下，该病表现为上皮性卵巢癌，占据了约90%的比例，具体包括浆液性、子宫内膜样、透明细胞及黏液性等亚型[2-3]，由于卵巢癌发病初期往往无明显症状，因此大约有70%的病例被发现时已进入晚期阶段。传统治疗手段主要依赖于手术与化疗相结合的方式，辅以靶向疗法和免疫疗法等多种综合措施。尽管许多患者在接受初次治疗后能够达到临床缓解状态，但仍有高达70%的人群会在接下来的2～3年内经历病情复发，长期存活率维持在40%左右[4]。鉴于此现状，探索和发展新的卵巢癌治疗方法显得尤为迫切。黄芩，作为一种在中国被广泛应用的草本植物，含有名为千层纸素A的关键黄酮类成分，该成分被认为拥有重要的药用价值。这种药材在中国有着悠久的应用历史，并且其治疗功效得到了广泛认可。近期的研究表明，千层纸素不仅能够有效对抗炎症反应、抑制恶性肿瘤的发展，还能够在维护血管与神经细胞健康方面发挥作用，同时能改善记忆力衰退状况以及增强抗病毒能力。临床实践中，通常采用黄芩的根部作为药材使用，除了千层纸素A之外，还包括黄芩素、汉黄芩素、黄芩苷及其衍生物等多种活性物质。19世纪时，SHAH等[5]研究者首次成功地从黄芩根皮中分离出了千层纸素A。特别是针对其抗癌效果的研究，在近年来吸引了众多国内外科研人员的关注，并逐渐应用于实际医疗场景中。深入探讨千层纸素A在疾病防治领域内的具体作用机理，将为开发新型治疗方法提供宝贵经验。

1、材料与方法

1.1实验材料

实验中使用了多种材料，其中包括从中国科学院细胞库（上海）获得的人卵巢癌细胞株A2780，DMEM高糖培养基和RPMI1640培养基（均来自BI公司）、胎牛血清（同样由BI提供）、千层纸素A（成都普菲德生物技术有限公司出品）、PBS缓冲液（BI）、CCK8试剂盒（Bimake）、Transwell小室（Millipore）。另外也备有0.25 %胰蛋白酶（Hyclone）用于特定步骤。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养

A2780细胞的培养采用的是含有10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃及5%二氧化碳浓度的条件下进行。每隔2～3 d更换1次培养液，直至细胞生长至覆盖培养表面约80%～90%时，使用0.25%胰酶处理以完成消化并传代。

1.2.2 CCK8实验

细胞消化与离心：首先，通过胰酶处理生长状态良好的细胞3 min，随后利用含有10%血清的RPMI-1640完全培养基来终止该消化过程。之后，将所获得的细胞悬液转移至15 mL容量的离心管内，并以10 000 r·min-1的速度进行5 min的离心操作。完成离心步骤后，去除上层液体，重新悬浮沉淀的细胞，并对其进行计数。细胞接种及培养过程如下：将计数完毕的细胞按照每孔1×104个细胞的数量分配至96孔板中，并将其置于预设条件为37℃且CO2浓度为5%的恒温培养箱内进行培养。次日，在该96孔板中加入千层纸素A，使用的浓度梯度包括0 mmol·L-1、35 mmol·L-1、70 mmol·L-1以及140 mmol·L-1，对于每一浓度水平均设置了3个重复样本以保证实验结果的可靠性。施药后，继续在相同条件下培养24 h。随后，向每个孔中添加10μL的CCK8试剂，之后再于培养箱中孵育2 h。最后，利用酶标仪测量各孔在450 nm波长下的光密度值（optical density，OD）。基于此数据，计算出细胞相对存活率，其公式为（OD实验组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白组）。

1.2.3克隆形成实验

首先，将细胞悬液以每孔1×103个细胞的密度接种到6孔培养板中。随后，使细胞在培养板上过夜以完成贴壁过程。接着，向各孔内加入不同浓度的千层纸素A作为处理条件。在此期间，每隔3 d更换1次培养基，并持续培养1～2周时间。当观察到明显的细胞集落形成时，则进入下一步骤。使用磷酸盐缓冲液（phosphate buff eredsaline，PBS）对细胞进行3次清洗后，利用4%多聚甲醛固定细胞15 min。然后，采用0.1%结晶紫染色剂对固定好的细胞染色15 min，之后再用PBS清洗3次以去除多余的染色剂。最后，在室温条件下使样本干燥，并拍摄记录下集落情况。为确保数据的准确性和重复性，整个实验需重复实施3次，并对每次形成的集落数量进行统计分析。

1.2.4划痕实验

在6孔板底部的每一孔中绘制三条平行线作为参考标记。将A2780细胞均匀分布于各孔之中。细胞完全融合后，采用枪尖垂直于基底划线的方法进行处理。随后使用PBS缓冲液清洗以去除被刮除的细胞。接着更换为含有不同浓度梯度（分别为0 mmol·L-1、35 mmol·L-1、70 mmol·L-1及140 mmol·L-1）千层纸素A的无血清培养基。在0 h和24 h时，观察并记录划痕的愈合情况。

1.2.5 Transwell实验

在进行Transwell实验时，首先在24孔板的上层添加一层基质胶，并让其自然固化。随后，在这层固化的基质胶之上接种经过不同浓度（分别为0 mmol·L-1、35 mmol·L-1、70 mmol·L-1及140 mmol·L-1）千层纸素A处理后的细胞样本。这些细胞被放置于无血清培养环境中生长，而下层则填充了完全培养基以促进细胞迁移。经过为期两天的培养后，移除未能穿透基质胶的上层细胞，对剩余细胞进行固定并染色处理。最后，通过清洗去除多余的染料后，仔细观察并通过记录来评估细胞侵袭的能力。

1.2.6流式细胞仪检测细胞凋亡

在千层纸素作用24 h后，先收集培养基中的液体部分。接着利用不含EDTA的胰蛋白酶对附着生长的细胞进行消化处理，在消化过程结束后将细胞沉淀收集起来，使用PBS缓冲液清洗3次以去除杂质。然后，向样品中添加FITC标记的Annexin V与碘化丙啶（PI），并在避光条件下进行15 min的染色反应。此外，设立空白对照组来校正实验数据。最终，用适量缓冲液重悬已染色的细胞，并通过流式细胞仪对其进行分析。

1.3统计学方法

本研究采用了GraphPad Prism 8软件来完成数据的可视化呈现与统计学分析，旨在识别不同组别间是否存在具有统计意义的差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1千层纸素A对卵巢癌细胞增殖作用的影响

采用CCK8实验观察发现，随着千层纸素A剂量的增加，A2780细胞的存活率呈现出显著下降的趋势。这一现象表明，千层纸素A能够以一种与药物浓度正相关的模式有效抑制卵巢癌A2780细胞的增长活性。见图1。

图1 CCK8检测千层纸素A对卵巢癌细胞增殖的影响

2.2千层纸素A抑制卵巢癌细胞的克隆形成能力

千层纸素A处理A2780细胞后，显著抑制了细胞的克隆形成能力。与未处理的对照组相比，这种抑制效果在统计学上具有显著性（P＜0.05）。见图2。

2.3千层纸素A抑制卵巢癌细胞的迁移

划痕实验结果显示，在经过24 h不同浓度（即0 mmol·L-1、35 mmol·L-1、70 mmol·L-1及140 mmol·L-1）的千层纸素A处理后，观察到该类细胞的迁移活性受到了显著抑制。见图3。

2.4千层纸素A抑制卵巢癌细胞的侵袭

transwell实验经过千层纸素A处理的A2780细胞相比未处理的对照组，在侵袭能力上表现出显著下降的趋势。见图4。

2.5千层纸素A诱导卵巢癌细胞的凋亡

采用AnnexinV-FITC/PI双染色实验结果显示，当A2780细胞暴露于不同浓度的千层纸素A（分别为0 mmol·L-1、35 mmol·L-1、70 mmol·L-1以及140 mmol·L-1）下持续24 h后，观察到了细胞凋亡现象的增强。见图5。

图2千层纸素A对卵巢癌细胞克隆形成能力的影响

图3在使用不同浓度的千层纸素A处理24 h后，A2780细胞系中划痕愈合的情况

图4千层纸素A处理24 h后，A2780细胞侵袭情况

图5千层纸素A作用24 h后，A2780细胞凋亡情况

3、讨论

卵巢癌在妇科恶性肿瘤中具有极高的致死率，其死亡率居女性生殖系统癌症之首。由于卵巢位于盆腔深处，大约80%的病例在确诊时已是晚期阶段，这使得5年生存率长期维持在约40%[6-7]。缺乏有效的早期检测手段、高度侵袭性导致的快速且广泛的腹部及远处转移以及治疗抵抗性共同构成了卵巢癌高死亡率的主要因素[8-9]。鉴于此，探究影响卵巢癌扩散与转移背后的分子机制对于改善该病的诊断和治疗方法至关重要。近年来，研究发现，多种天然化合物展现出了对抗癌症的巨大潜力，其中黄酮类化合物尤为引人注目。这类天然产物能够通过抑制癌细胞生长、迁移及其侵袭能力等多种途径发挥抗癌效果[10-11]。例如，木犀草素与槲皮素均被证实可促进细胞凋亡并抑制细胞分裂，从而达到抗肿瘤的目的[12-13]。

千层纸素A，作为一种受到广泛关注的天然黄酮类化合物，已被证实具备多种生物活性。相较于传统抗肿瘤药物，它表现出更高的疗效与更低的毒性，因此展现出极高的研究价值和发展潜力。近年来，国内外学者的研究表明，这种从中药黄芩中提取的黄酮类物质对于包括肝癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌及胆囊癌在内的多种癌症类型显示出潜在的抗癌效果。相关发现不仅阐明了千层纸素A在抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡、阻断细胞周期进程以及抑制肿瘤转移等方面的作用机制，还为其作为新型抗癌药物的研发奠定了坚实的理论基础和实验依据。有研究[15]表明，千层纸素A能够通过激活Caspase-8来触发外源性细胞凋亡过程，从而导致人肝癌细胞死亡并抑制其生长；ZHAO等[14]的工作指出，该化合物可以浓度依赖性和时间依赖性地抑制乳腺癌细胞的增长；NI等[16]则探索了千层纸素A对结肠癌脂质代谢调控的影响，在低氧条件下，激活的HIF-1α 会促进脂肪酸代谢相关蛋白的转录，减少CPT1表达量，进而增加脂肪酸水平及脂质累积，高浓度游离脂肪酸进一步激活Wnt/β-Catenin经典通路，促进结肠癌发展；此外，SHEN[17]团队观察到，千层纸素A能逆转由肺癌细胞与人类外周血单核细胞共同培养所引起的调节性T细胞（Tregs）生成现象。

综上所述，千层纸素A能够有效抑制卵巢癌细胞的增长、迁移及侵袭行为，并促进细胞凋亡。这项成果不仅对于传统中药及其主要活性成分药理机制的理解，还为相关药物的研发开辟了新的路径。

基金资助:吉林省科学技术厅项目(20220508081RC,20240401074YY);

文章来源:尹思源,越皓.千层纸素A对卵巢癌细胞的抗肿瘤作用机制[J].长春中医药大学学报,2025,41(04):393-397.