胃癌是最常见的致死性癌症之一，致死率在癌症中位居第2位[1,2]。尽管早期诊断、手术和辅助治疗改善了胃癌患者的预后，但由于大多数患者确诊时已发展为晚期，对于胃癌的治疗，目前仍无特效药物，因而导致其死亡率不断上升[1,2,3,4,5]。雷公藤红素是从雷公藤TripterygiumwilfordiiHook.f.、南蛇藤CelastrusorbiculatusThunb.等卫矛科植物提取的具有醌甲基结构五环三萜类单体化合物，研究表明其对结肠癌、肺癌、胃癌、白血病、胶质瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌等疾病均表现出很好的抗肿瘤作用[6,7,8,9,10]。PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活能够导致机体细胞的异常增殖，从而导致肿瘤的发生[11,12]。近年来研究发现雷公藤红素对胃癌细胞具有很好的抗肿瘤活性[13,14,15]，但其作用机制尚不明确。本文通过研究雷公藤红素抑制胃癌MFC细胞增殖及促凋亡作用，为雷公藤红素的临床应用提供依据。

1、材料与方法

1.1材料

雷公藤红素购买自成都格利普生物科技有限公司（批号201908261，质量分数≥98%）；胃癌MFC细胞购自中科院上海细胞库（批号A3561);PI3K、AKT、mTOR、Bax、Bcl-2和GAPDH抗体均购自Proteintech公司（批号20584-1-AP、10176-2-AP、20657-1-AP、50599-2-Ig、12789-1-AP、10494-1-AP）；细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、RIPA蛋白裂解液购自上海碧云天公司（批号：C1052、P0013B),RPMI1640培养基购自北京索莱宝科技有限公司（批号31800);ECL显色液购自Thermo公司（批号32106);RNA提取试剂盒和逆转录cDNA试剂盒购自Promega公司（批号Z3100、A3500);DxFLEX流式细胞仪购自贝克曼库尔特商贸有限公司，1658001双垂直电泳仪、DYC-ZY2转印电泳仪、SYSTEMGelDocXR凝胶成像仪均购自伯乐生命医学产品有限公司。

1.2细胞培养和传代

从-80℃冰箱中取出MFC细胞冻存管，于37℃恒温水浴箱轻轻摇动，溶解后移至酒精消毒过的超净工作台，用移液枪吸出管内细胞悬液，转移至10mL无菌离心管中，加入适量的RPMI1640培养基（含10%胎牛血清），1000r/min条件下离心8min。弃去上清，加入适量培养基，轻轻吹打使细胞重悬，并小心接种于培养皿中，置于37℃、5%CO2恒温培养箱培养，每天更换新鲜培养液，隔天进行传代，当细胞传至第10代时，方可进行后续试验。

1.3MTT法检测雷公藤红素对胃癌MFC细胞增殖的影响

根据预实验结果在96孔板上分别设置雷公藤红素高、中、低剂量组、对照组和凋零组，每组设置3个复孔，凋零组只加入等量培养液，不加入细胞悬液，其余各组加入对数生长期的MFC细胞，并使其密度为0.5×104个/mL。各组在37℃、5%CO2培养箱中培养24h，然后对照组和凋零组加入新鲜培养液，雷公藤红素低、中、高剂量组分别加入雷公藤红素，使其最终浓度分别为5、10、20mmol/L，继续于培养箱中培养72h。培养结束后，在避光的环境下每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），于培养箱中避光孵育4h，然后轻柔地吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，置于振荡器上震荡5min至蓝紫色结晶完全溶解后于酶标仪490nm处测定吸光度（A）值，并按照如下公式计算细胞抑制率。

1.4流式细胞术检测雷公藤红素对胃癌MFC细胞周期的影响

使用6孔板分别设置对照组和雷公藤红素5、10、20mmol/L组，每组设置3个复孔。取对数生长期的MFC细胞悬液，使其密度成1×104个/mL接种于6孔板中，然后将6孔细胞培养板置于细胞培养箱静置培养12h左右。待细胞均贴壁以后，吸出培养基，再按照分组进行加药处理。将6孔细胞培养板放置细胞培养箱中，继续培养72h。收集MFC细胞，用1×PBS洗2遍后去除PBS，加入预冷的70%乙醇固定，过夜。次日取出，2500r/min离心5min,4℃，用移液枪吸除上清液，涡旋震荡使MFC细胞松散。用1×PBS洗涤MFC细胞两次。洗涤后，加入已配好的碘化丙啶染色液，37℃染色30min后，进行细胞周期检测。

1.5AnnexinV-FITC/PI双染法检测雷公藤红素对胃癌MFC细胞凋亡的影响

使用6孔板分别设置对照组和雷公藤红素5、10、20mmol/L组，每组设置3个复孔。取对数生长期的MFC细胞悬液，使其密度成1×104个/mL接种于6孔板中，然后将6孔细胞培养板置于细胞培养箱静置培养12h左右。待MFC细胞均贴壁以后，吸出培养基，再按照分组进行加药处理。将6孔细胞培养板放置细胞培养箱中，继续培养72h。培养完成后，使用PBS洗涤MFC细胞，加入适量不含EDTA的胰酶消化收集MFC细胞并1000r/min离心5min，弃上清，加入适量培养基重悬细胞后，2000r/min离心5min，弃上清液，加入300μL1×bindingbuffer悬浮细胞后，再加入5μLAnnexinV-FITC混匀后，避光，室温孵育15min，然后加入5μL碘化丙啶（PI）染色液，轻轻混匀，冰浴避光孵育5min，最后加入200mL1×bindingbuffer，立即用流式细胞仪检测。

1.6Westernblotting法检测雷公藤红素对胃癌MFC细胞内凋亡相关蛋白的影响

将培养好的MFC细胞接种于6孔板，调节细胞密度为1×104个/孔，24h后吸去上清液，对照组加入新鲜培养基，雷公藤红素低、中、高剂量组加入雷公藤红素，使其最终浓度分别成5、10、20mmol/L，各组作用72h后，收集各组细胞，分别加入裂解液提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，处理好待测样品后，取50μg蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，转膜，将分离的蛋白电转移至PVDF膜上。封闭液室温封闭1h，经Bax、Bcl-2、PI3K、Akt、mTOR抗体（1∶1000）孵育，4℃过夜。PBST充分洗膜后，加入二抗（1∶2000）室温孵育1h,PBST清洗后显色液显影，利用凝胶成像仪成像后，进行灰度值检测。

1.7实时定量PCR法检测雷公藤红素对胃癌MFC细胞内PI3K、AKT和mTORRNA表达的影响

采用Promega公司的RNA提取试剂盒分别提取雷公藤红素5、10、20mmol/L作用72h后的胃癌MFC细胞的总RNA。将提取的总RNA逆转录成cDNA后，荧光定量PCR检测MFC细胞中β-actin、PI3K、AKT和mTORmRNA的表达水平。各检测基因的实时定量PCR引物见表1，实时定量PCR结果采用2-△△Ct法计算相对表达量。

表1用于实时定量PCR检测的基因引物序列

1.8数据处理

应用统计学软件SPSS19.0对数据进行分析及Graphpadprism5进行作图，应用ImageJ软件进行免疫印迹灰度值检测，计量资料用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

2、结果

2.1雷公藤红素对胃癌MFC细胞的增殖抑制作用

与对照组相比，雷公藤红素能够显著抑制MFC细胞的增殖（P<0.05），且随着雷公藤红素剂量的增加，雷公藤红素对MFC细胞的增殖抑制作用逐渐增强（P<0.05），即表现出剂量相关性；提示雷公藤红素能够呈剂量相关性地抑制胃癌MFC细胞的增殖。见表2。

2.2雷公藤红素对胃癌MFC细胞周期的影响

与对照组相比，雷公藤红素5、10、20mmol/L组MFC细胞均出现显著的G2/M期阻滞现象（P<0.05），且随着雷公藤红素剂量的增大，G2/M期的MFC细胞所占的比例也增加，即MFC细胞G2/M期阻滞加重；提示雷公藤红素能够呈剂量相关性地诱导胃癌MFC细胞G2/M期阻滞，干扰胃癌MFC细胞的细胞周期，从而抑制胃癌MFC细胞的增殖，见表3、图1。

2.3雷公藤红素对胃癌MFC细胞凋亡的影响

与对照组相比，雷公藤红素能够显著性促进MFC细胞的凋亡（P<0.05），且随着雷公藤红素剂量的增大，MFC细胞凋亡比例也不断增加（P<0.05）；这提示雷公藤红素能够呈剂量相关性诱导胃癌MFC细胞凋亡，从而起到抗肿瘤作用，见图2和表4。

2.4雷公藤红素对胃癌MFC细胞内Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

与对照组相比，雷公藤红素作用于胃癌MFC细胞72h后，雷公藤红素5、10、20mmol/L组胃癌MFC细胞内Bax蛋白表达水平显著增加（P<0.05），且表现出剂量相关性，然而，雷公藤红素5、10、20mmol/L组MFC细胞内Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P<0.05），同样表现出剂量相关性；提示雷公藤红素能够呈剂量相关性地促进胃癌MFC细胞内Bax蛋白的表达，同时呈剂量相关性地抑制胃癌MFC细胞内Bcl-2蛋白的表达。见图3和表5。

表2雷公藤红素对胃癌MFC细胞的增殖抑制作用（x±s,n=3)

表3雷公藤红素对胃癌MFC细胞周期的影响（x±s,n=3)

图1雷公藤红素对胃癌MFC细胞周期的影响

图2雷公藤红素对胃癌MFC细胞凋亡的影响

表4雷公藤红素对胃癌MFC细胞凋亡的影响（x±s,n=3)

图3雷公藤红素对胃癌MFC细胞内Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

表5雷公藤红素对胃癌MFC细胞内Bax、Bcl-2蛋白表达的影响（x±s,n=3)

2.5雷公藤红素对胃癌MFC细胞内PI3K、AKT和mTOR蛋白表达的影响

与对照组相比，雷公藤红素能够显著抑制胃癌MFC细胞内PI3K、AKT及mTOR蛋白的表达（P<0.05），且随着雷公藤红素剂量的增加，MFC细胞内PI3K、AKT和mTOR蛋白的表达量也逐渐降低（P<0.05），即表现出剂量相关性；提示雷公藤红素能够呈剂量依赖性的显著抑制胃癌MFC细胞内PI3K、AKT和mTOR蛋白的表达，从而抑制MFC细胞的增殖。见图4、表6。

2.6雷公藤红素对胃癌MFC细胞内PI3K、AKT和mTORmRNA表达的影响

与对照组相比，雷公藤红素5、10、20mmol/L组胃癌MFC细胞内PI3K、AKT和mTORmRNA表达水平均显著下降（P<0.05），且随着雷公藤红素剂量的增加，PI3K、AKT和mTORmRNA表达水平也不断降低（P<0.05）；提示雷公藤红素能够呈剂量相关性地显著抑制胃癌MFC细胞内PI3K、AKT和mTORmRNA表达水平，从而抑制胃癌MFC细胞PI3K、AKT和mTOR的表达，雷公藤红素对胃癌MFC细胞内PI3K、AKT和mTORmRNA表达的影响见表7。

图4雷公藤红素对胃癌MFC细胞内PI3K、AKT和mTOR蛋白表达的影响

表6雷公藤红素对胃癌MFC细胞内PI3K、AKT和mTOR蛋白表达的影响

表7雷公藤红素对胃癌MFC细胞内PI3K、AKT和mTORmRNA表达的影响（x±s,n=3)

3、讨论

随着近年来胃癌的发生率不断升高，对于胃癌的治疗越来越受到人们的重视，目前临床上常用的治疗胃癌的药物大多存在消化道不良反应及引起肝肾功能异常等副作用，这不仅可能加剧胃癌患者疾病的进一步进展，还严重影响患者的生存质量，而且，这些药物还可能存在无效的现象。据报道，胃癌的发生与地理位置、饮食、幽门螺杆菌感染、胃酸分泌减少及遗传因素有关。因此，胃癌被认为是一种高度异质性的疾病。近年来，已发现多种蛋白表达异常参与胃癌的发生和发展，包括p53、EGFR、PTEN和PI3K/AKT/mTOR等[5,6,7,8,11]。

PI3K/AKT/mTOR通路是由调节细胞生长、细胞存活、细胞周期进程、蛋白质翻译和代谢等多种生理功能的多种细胞刺激激活的。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶[12,13,14,15,16,17]，其本身具有丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）激酶的活性，可以和蛋白激酶B(PKB,Akt）的N端PH结构域结合。使Akt从细胞质转移到细胞膜上，促进Akt蛋白上的苏氨酸磷酸化位点（Thr308）和丝氨酸磷酸化位点（Ser473）磷酸化而使其激活。激活后的Akt通过直接和间接两种途径激活其底物雷帕霉素靶体蛋白（mTOR）：直接磷酸化mTOR，或通过失活结节性硬化复合物2(TSC2）从而维持Rheb的GTP结合态，然后增强mTOR的激活。研究证实肿瘤抑制基因通过实现PI3K/Akt信号通路的负性调节，从而起到抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用。Bax是细胞中促凋亡基因，而Bcl-2是细胞中抑制凋亡的基因，有研究表明，PI3K/AKT/mTOR通路的异常激活能够促进Bcl-2的表达，抑制Bax的表达，促进细胞增殖；而抑制PI3K/AKT/mTOR通路则可以促进Bax的表达，抑制Bcl-2的表达，促进细胞凋亡[12,13,14,15]。所以，调节PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达，能够调节细胞内相关凋亡信号的表达，进而发挥抗肿瘤作用。

雷公藤红素又名南蛇藤素，是从雷公藤TripterygiumwilfordiiHook.f.、南蛇藤CelastrusorbiculatusThunb.等卫矛科植物提取的具有醌甲基结构五环三萜类单体化合物，是治疗类风湿病药物雷公藤片、雷公藤多苷片等制剂的主要有效成分之一。雷公藤红素在前列腺癌、肝癌、肺癌、白血病、胶质瘤、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌等肿瘤细胞中均有抗肿瘤作用。研究表明雷公藤红素可抑制血管内皮生长因子VEGF和JNK等信号通路而起到对抗胃癌、结肠癌的作用，而雷公藤红素对胃癌细胞中PI3K/AKT/mTOR通路作用目前尚无明确报道[6,7,8]。

本文主要研究了雷公藤红素5、10、20mmol/L对MFC细胞的增殖抑制作用及促凋亡作用，结果表明雷公藤红素能够呈剂量相关性地显著抑制胃癌MFC细胞的增殖；同时，雷公藤红素能够呈剂量相关性地显著抑制MFC细胞内PI3K、AKT和mTORmRNA的表达水平，并能够呈剂量相关性地显著抑制MFC细胞内PI3K、AKT和mTOR蛋白的表达，这表明雷公藤红素抑制胃癌MFC细胞增殖的作用机制可能是通过抑制MFC细胞内PI3K/AKT/mTOR信号通路中PI3K、AKT和mTOR蛋白的表达，从而抑制了该通路下游相关靶点蛋白的激活，也阻断了该通路上游蛋白信号的传导，从而发挥其抗肿瘤活性细胞周期检测结果表明，雷公藤红素能够呈剂量相关性地显著引起MFC细胞G2/M期阻滞；细胞凋亡检测结果表明，雷公藤红素能够呈剂量相关性地显著诱导MFC细胞的凋亡，同时雷公藤红素能够呈剂量依赖性的显著促进MFC细胞内促凋亡蛋白Bax的表达，同时抑制MFC细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，这表明雷公藤红素对胃癌MFC细胞的促凋亡的机制可能是通过抑制细胞内PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活，进而促进胃癌MFC细胞内促凋亡蛋白Bax蛋白的表达，同时抑制抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达

综上所述，雷公藤红素能够抑制胃癌MFC细胞的增殖并促进胃癌MFC细胞凋亡，其作用机制可能是通过抑制胃癌MFC细胞内PI3K/AKT/mTOR信号通路中PI3K、AKT、mTOR等蛋白的表达而抑制胃癌MFC细胞的增殖，进而促进胃癌MFC细胞内促凋亡蛋白Bax的表达，同时抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而促进胃癌MFC细胞凋亡。

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