肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TIL)存在于肿瘤微环境中，是肿瘤实质和肿瘤间质内的以T淋巴细胞为主的一类异质性淋巴细胞群体，主要由T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞(DC)、巨噬细胞和髓源性抑制细胞等组成[1]。基于TIL的细胞治疗，通常包括三个阶段：① 从患者体内切除肿瘤组织(一般为2～3 cm)，肿瘤样本被机械切割为小碎片，或被酶消化为单细胞悬液；② 体外分离、白细胞介素(IL)-2中培养和扩增TIL；③ 回输到患者体内，对肿瘤发挥特定的杀伤作用[2]。TIL为直接从肿瘤样品中分离得到的T淋巴细胞，因此被认为对肿瘤相关抗原具有特异性，同时TIL也未经过基因修饰，并且为患者自体细胞，故不良反应相对较少，这是TIL疗法的一大优势[3]。TIL在肿瘤微环境中发挥着重要的作用，并在对抗许多肿瘤的癌变过程中起着核心的作用，其中CD8 T淋巴细胞是T细胞毒性淋巴细胞，能够影响肿瘤的生长和转移潜能，CD4 T淋巴细胞通过分泌多种细胞因子促进CD8淋巴细胞的增殖，FOXP3T淋巴细胞是T淋巴细胞调节因子，表达CD25抗原和FOXP3转录因子[4]。近年来，国内外已开展了大量针对黑色素瘤、肺癌等肿瘤的TIL疗法的临床试验，使用IL-2在体外培养、激活和扩增后，可获得较好的抗肿瘤效果，该疗法可能是治疗实体瘤最有潜力的细胞治疗方法之一[5-6]。基于TIL细胞的创新疗法，LN-144是全球第一个进入临床的产品，用于治疗晚期黑色素瘤，该产品在 2019年获得了美国FDA的突破性治疗药物认证，并于2024年2月在美国上市，成为第一款上市的TIL细胞。中国国家药品监督管理局药品审评中心官网显示，国内多种TIL疗法获批临床，包括GT101、GC101 TIL、ZLT-001、HV-101注射液等。

肺癌是一种患病率和死亡率都很高的恶性疾病，其中85%的肺癌患者为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)[7]，NSCLC有多种治疗方法，包括手术、化疗、放疗和靶向治疗等，但上述治疗手段，患者的生存期均有限，且化疗、放疗和靶向治疗均有一定的毒副反应，因此亟需一种新型治疗方法用于NSCLC的治疗。近年来，随着研究的深入，癌症的免疫疗法获得了巨大的进步[8]。目前，TILs作为免疫疗法的一种，也有望成为治疗肺癌的新方法。本研究受试物为北京循生生物医学研究有限公司研发，从肺癌患者肿瘤组织中提取，用于NSCLC的治疗。研究中使用非荷瘤NOG小鼠静脉给予TIL，观察TIL细胞在小鼠体内的毒性反应，评估TIL细胞毒性风险，为本产品进入临床试验提供数据支持，报道如下。

1、材料

1.1 细胞注射液和溶媒

本研究使用的细胞注射液和溶媒均由北京循生免疫医学转化研究院提供，细胞注射液主要成分为人TIL、人血白蛋白和氯化钠注射液。在每次给药当日，将TIL配制为1.25×107个·mL-1和5×107个·mL-1，并在6 h内完成给药。

1.2 动物

SPF级NOG小鼠，雌雄各半，6～7周龄[北京维通利华实验动物技术有限公司(动物生产许可证号：SCXK(京)2021-0006)]，雄鼠17.8～21.6 g；雌鼠14.2～17.7 g。在温度20～26℃、湿度40%～70%、12 h照明条件下饲养。提供经钴60放射灭菌的鼠全价颗粒饲料，自由摄食及饮水。本实验方案实施前已经动物管理与使用委员会伦理审查批准，研究中所有实验动物相关的操作严格按照国际实验室动物伦理行为准则”Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”实施。

1.3 仪器

自动包埋机(德国LEICA公司，型号：EG1150)；自动染色机(型号：DRS-2000)、封片机(型号：TEC5E MJ-2型)(日本Sakura公司)；光学显微镜(日本Olympus公司，型号：BX51)；流式细胞计数仪(美国BD公司，型号：FACS calibur和FACS Aria Ⅲ)；综合血液学检查装置(日本Sysmex公司，型号：XN-550)；全自动生化分析仪(日本日立公司，型号：7180)。

1.4 试药

PhPerCP Mouse Anti-Human CD3(批号：0205481)、Ph PE Mouse Anti-Human CD4(批号：9172628)、PE FITC Mouse Anti-Human CD8(批号：0104976)、流式液相多重蛋白定量技术(CBA)Human Th1/Th2 Cytokine KitⅡ(批号：1127262和1207654)(美国BD公司)；注射用人IL-2(北京四环生物制药有限公司，批号：20210316-2)。

2、方法

2.1 实验设计

使用174只小鼠(雌雄各半)，分为主实验组和卫星组，主实验组设置4个组别：溶媒对照组(给予溶媒)、IL-2对照组(给予IL-2)、TIL低剂量组(5×106个/只)及TIL高剂量组(2×107个/只)，卫星组设置3个组别：溶媒对照组(给予溶媒)、TIL低剂量组(5×106个/只)及TIL高剂量组(2×107个/只)。溶媒对照组、TIL低剂量组和高剂量组，经小鼠尾静脉给药，每只给予400 µL，每周1次，共给药3次。IL-2对照组、TIL低剂量组和TIL高剂量组在首次给药第1日到末次给药后第7日期间，腹腔注射IL-2(4000 IU/只)，每日注射1次，末次给药后设置4周恢复期，分别于3次给药结束(10只/性别/组)和恢复期(5只/性别/组)结束解剖动物。实验期间，对主实验组动物进行临床症状、注射部位刺激性观察、摄食量和体重测定、血液学和血清生化检查、人源细胞因子检测和组织病理学检查等。卫星组设置2套动物轮换采血，每套动物设置3只/性别/组，动物于首次给药后30 min、3 h、24 h，末次给药后30 min、3 h、24 h、6 d、15 d、29 d采血，流式细胞术检测受试物在血液中的分布情况。

2.2 指标检测

细胞注射液每次给药当天，主实验组给药前和给药后隔笼观察所有动物是否死亡、濒死、活动状况、外观及被毛、有无外伤、粪便等情况，并观察注射部位有无刺激性；每周测定体重2次，每周测量摄食量1次。在给药结束和恢复期结束时异氟烷麻醉后解剖，采血，对动物血清生化和血液学指标进行测定，使用CBA方法检测血清中人源细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)、IL-6、IL-10、IL-2、TNF、IL-4浓度(5只/性别/点)，并对动物43种脏器进行组织病理学检查。使用流式方法检测卫星组动物在不同时间点(3只/性别/点)血液中人源CD3+、CD3+CD4+细胞和CD3+CD8+细胞个数。

流式检测方法：3 种抗体按照每个样本3 μL 加至流式管中，吸取50 μL抗凝血至含抗体的流式管中，避光孵育30 min，后加入国家药物安全评价监测中心自制的红细胞裂解液，待溶液澄清即刻200g×5 min离心，去上清液加入400 μL PBS，200g×5 min 离心，清洗1 次，最后加入300 μL的4%多聚甲醛固定，上机检测。

血液学指标：白细胞数(WBC)、中性粒细胞(Neut)绝对值及百分比、淋巴细胞(LYM)绝对值及百分比、单核细胞(Mono)绝对值及百分比、嗜酸性粒细胞(Eos)绝对值及百分比、嗜碱性粒细胞(Baso)绝对值及百分比、红细胞数(RBC)、血红蛋白浓度(HB)、红细胞比容(HCT)、平均红细胞容积(MCV)、平均血红蛋白量(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)、血小板数(PLT)、平均血小板容积(MPV)、网织红细胞绝对值及百分比(Retic)。

血清生化指标：谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、肌酸磷酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、总胆红素(TBiL)、尿素氮(UREA)、肌酐(CRE)、葡萄糖(GLU)、总胆固醇(CHO)、三酰甘油(TG)、总蛋白质(TP)、白蛋白(ALB)、白蛋白/球蛋白(A/G)、血清钾(K+)、血清钠(Na+)和血清氯(Cl-)。

2.3 统计学分析

用Bartlett检验方法进行数据均一性检验，如果数据均一(检验P>0.05)，则进行方差分析检验(F检验)，进一步用Dunett参数检验法进行多重比较检验；如结果数据不均一(P≤0.05)，则进行Kruskal-wallis检验，进一步用Dunett非参数检验法进行多重比较检验。当P<0.05，认为差异具有统计学意义。卫星组动物受试物检测数据，为收集5000个细胞中CD3+、CD3+CD4+细胞和CD3+CD8+细胞个数。图片由GraphPad Prism 8.0.2软件处理生成。

3、结果

3.1 临床症状及注射部位情况

实验期间，雄性溶媒对照组1只动物在恢复期第12日死亡，该动物实验期间临床症状、体重等都未见异常，剖检可见脾脏体积增大、十二指肠透明囊泡、胸腔脓性积液，组织病理学结果显示，胸腔及腹腔多个脏器出现炎症性病变，提示动物存在较为严重的感染。综合该只动物大体及镜检检查结果，推测该动物因严重的肺(含支气管)感染而导致呼吸衰竭死亡。雌性动物低剂量组1只在恢复期第1日死亡，该动物实验期间临床症状、体重等都未见异常，大体剖检未见异常。镜检可见注射部位(尾巴)极轻度炎症细胞浸润、极轻度血栓形成、极轻度血管壁变性/坏死。

各组动物在3次尾静脉给药后，注射部位观察未见异常，组织病理学结果显示，溶媒对照组15只(总20只)动物注射部位(尾巴)可见极轻度炎症细胞浸润；低剂量组14只(总19只)动物注射部位(尾巴)可见极轻度(11只)至轻度(3只)炎症细胞浸润；高剂量组18只(总20只)动物注射部位(尾巴)可见极轻度(14只)至轻度(4只)炎症细胞浸润。2个剂量组发现动物注射部位炎症细胞浸润、血管壁变性/坏死，且发生频度和/或病变程度高于溶媒对照组，提示给予受试物可能加重注射部位炎症细胞浸润、血管壁变性/坏死的病变。

3.2 体重和摄食量

与同期溶媒对照组相比，雄性低剂量组和高剂量组动物在给药期和恢复期体重，差异未见统计学意义。

与同期溶媒对照组相比，雌性动物低剂量组动物体重在恢复期第1周第2次测定、第2周第1次和第3周第1次测定时，体重下降(P<0.01)，分别下降约11.0%、14.2%和9.0%。与给药结束前体重相比，恢复期第1周第1次测定时，溶媒对照组、IL-2组、低剂量组和高剂量组动物体重增长率分别为8.5%、5.3%、0.5%和6.3%。与恢复期第1周第1次测定相比，恢复期第1周第2次测定时，各组体重增长率分别为6.3%、1.0%、6.0%和0.0%，低剂量组动物体重增长率与溶媒对照组无明显差别。虽然低剂量组个别时间点体重下降，但未表现出明显的剂量相关性，各时间点体重增长率也未出现剂量相关性，考虑低剂量组动物仅个别时间点体重下降具有统计学意义，无明显的毒理学意义(见表1～2)。

各组动物在给药期摄食量未见异常。恢复期时，每组仅有两笼，未进行统计分析，但各时间点各组动物摄食量未见异常(见表3)。

表1TIL给药期NOG小鼠体重(

表2恢复期NOG小鼠体重(

3.3 血液学指标

雄性动物在给药结束后，与同期溶媒对照组相比，高剂量组WBC和LYM%升高(P<0.05)，分别约升高1.12倍和1.27倍，但是与IL-2组相比，差异未见统计学意义，且未出现剂量依赖性，雌雄之间也无一致性规律，认为出现统计学差异与受试物无关，仅具有统计学意义；恢复期结束后，低剂量组PLT下降(P<0.05)，约下降19.9%，低剂量组与IL-2组和高剂量组相比，PLT数未见明显异常，溶媒对照组PLT数比给药结束时PLT数高，认为低剂量组PLT数下降出现的统计学差异与溶媒对照组PLT数升高有关，与受试物无关。低剂量组MPV升高(P<0.01)，约升高3.1%，MPV升高幅度较小，且无明显剂量依赖性，认为仅差异具有统计学意义但无毒理学意义。雌性动物血液学指标未见异常(见表4)。

3.4 血清生化指标

雄性动物给药结束时，高剂量组UREA浓度升高，约升高51.5%，恢复期结束时，UREA浓度恢复正常，未见统计学差异。组织病理学结果显示，给药结束时，未见与肾脏相关的组织病理学改变，因此考虑UREA异常无毒理学意义；恢复期结束时，低剂量组动物TBiL降低(P<0.05)，约下降24.6%，见表5。组织病理学结果显示，雄性动物在恢复期结束时，未见与受试物相关肝脏病变，因此考虑TBiL异常无毒理学意义。恢复期结束时，低剂量组A/G比值升高(P<0.05)，约升高18.5%，A/G比值升高仅出现在低剂量组，高剂量组差异未见统计学意义，未见剂量相关性，认为低剂量组A/G比值升高与受试物无关。

雌性动物给药结束时，IL-2组和高剂量组动物A/G比值降低(P<0.05)，分别下降约12.5%和12.1%，IL-2组和高剂量组无明显差异，且未呈现剂量依赖性，认为该差异与受试物无关。恢复期结束时，血清生化各个指标差异未见统计学意义。

3.5 血液中人源CD3+、CD3+CD4+细胞和CD3+CD8+细胞检测

人CD3+、CD3+CD4+细胞和CD3+CD8+细胞检测结果见图1、2。低剂量和高剂量组在不同时间点3种细胞变化趋势一致，高剂量组动物检测出3种细胞数量均高于低剂量组。首次给药后30 min，低剂量组和高剂量组即可检测到3种细胞亚群。首次给药后3 h，细胞数量降低，至首次给药后24 h，低剂量组和高剂量组3种细胞亚群数量达到第一个峰值。在末次给药后30 min、3 h和24 h检测时间点，CD3+、CD3+CD4+细胞数趋势与首次给药后趋势一致，3 h时最低，24 h达到峰值。末次给药后24 h后，低剂量组和高剂量组CD3+、CD3+CD4+细胞数量逐渐降低，至末次给药后29 d(恢复期结束时)细胞数量较低，接近溶媒对照组检测到的细胞数量。对于CD3+CD8+细胞，在末次给药后6 d时，细胞数量达到峰值，至给药后29 d，细胞数量接近于零。

图1 TIL给药后小鼠血清中CD3+、CD3+CD4+细胞和CD3+CD8+细胞变化趋势图(

图2 TIL给药后小鼠血清中CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞流式检测结果

3.6 人源细胞因子检测

雄性动物给药结束时和恢复期结束时以及雌性动物给药结束时，各剂量组IFN-γ、TNF、IL-10、IL-6、IL-4和IL-2等细胞因子检测数据低于定量下限或检测出动物只数少，不再统计分析。雌性动物恢复期结束时，溶媒对照组动物IFN-γ浓度均低于检测下限，但高剂量组4只动物IFN-γ检测数据高于定量上限，IFN-γ浓度均值为(14.72±6.5)pg·mL-1。上述结果提示，受试物细胞能够分泌IFN-γ，可能与TIL药理作用有关。

3.7 脏器重量

各组动物脏器重量绝对重量和相对重量未见异常，且差异未见统计学意义。

3.8 病理学改变

本研究与受试物相关的主要病理学改变为肺(含支气管)、肾脏、脾脏、肝脏、阴道、甲状腺、肾上腺、脑、颌下腺、舌下腺、胰腺、肌肉(骨骼肌)、前列腺、精囊腺、附睾、哈氏腺、皮肤混合细胞聚集，以及胸骨(骨髓)和骨(单侧大腿骨)骨髓细胞数目增多。考虑上述脏器所见混合细胞聚集的情况体现TIL在实验动物体内增殖及诱导其他免疫相关细胞增殖的过程，是其发挥药效学作用的表现，胸骨(骨髓)和/或骨(单侧大腿骨)骨髓细胞数目增多考虑为给予TIL后进一步促进机体免疫应答反应的体现(见图3)。

4、讨论

4.1 毒性结果

参考本中心前期TIL细胞实验结果及药代动力学结果，研究使用非荷瘤NOG小鼠对治疗NSCLC的TIL细胞开展体内安全性评价。IL-2在TIL生产过程中发挥了重要的作用，是T细胞扩增、存活和发挥功能所必需的因子，因此TIL置于IL-2的培养基中培养[9-10]。研究表明，与接受低剂量IL-2相比，接受高剂量IL-2治疗的患者存活率有所提高[11-12]。本产品在临床使用时与IL-2联用，在本实验中，两个剂量组从首次给药第1日到末次给药后第7日期间，NOG小鼠每日腹腔注射1次人IL-2(4000 IU/只)。因人IL-2对小鼠来说为外源物质，可能会产生临床不会出现的毒性反应，故设置单独给予人IL-2的小鼠对照组，观察小鼠对IL-2所产生的毒性反应，以便区分TIL所产生的毒性。本研究根据前期药效结果设置给药低剂量和高剂量组，剂量分别为5×106个/只和2×107个/只，未见与TIL相关的临床症状、体重、摄食量、血液学和血清生化指标异常，在2×107个/只剂量下仅发现雌性恢复期动物血清中人IFN-γ浓度显著升高，这可能与TIL药理学功能有关[13]。

因重度免疫缺陷小鼠免疫功能有限，常检测小鼠血清中人源细胞因子[14]。与CAR-T细胞治疗不同，因TIL产品中表达患者特异性T细胞受体，TIL产品一般情况下不会引起细胞因子释放综合征以及与免疫效应细胞相关的神经毒性[15]，本研究中也未观察到除IFN-γ外其他细胞因子的释放，也未发现与神经毒性相关的动物临床症状的异常。有研究表明，临床上给予高剂量的IL-2，可能会引起严重的毒性反应，常见的毒性反应例如系统性的毛细血管渗透综合征、肺水肿以及肾衰竭等[16]，本实验设置了IL-2对照组，未发现相关毒性，出现此种结果，一方面人类与小鼠免疫系统有差异，另一方面实验采用免疫缺陷小鼠开展研究，小鼠免疫系统不健全，无法充分暴露IL-2所产生的毒性。

图3 与TIL相关的NOG小鼠组织病理学改变典型图片(HE染色，×400)

给药结束及恢复期结束进行组织病理学检查，结果显示与给予TIL有关的主要病理学改变是多个脏器混合细胞聚集，以及胸骨(骨髓)和骨(单侧大腿骨)骨髓细胞数目增多。多个脏器混合细胞聚集的主要组成细胞是人肿瘤组织浸润淋巴细胞和给予TIL后增生的各种免疫相关细胞(以单核巨噬细胞和粒细胞为主)。上述情况体现了TIL在实验动物体内增殖及诱导其他免疫相关细胞增殖的过程，考虑是其发挥药效学作用的表现。恢复期结束低剂量组及高剂量组胸骨(骨髓)和/或骨(单侧大腿骨)骨髓细胞数目增多考虑为给予TIL后进一步促进机体免疫应答反应的体现。本实验未发现TIL在雌性和雄性NOG小鼠中的毒性结果的差异。

4.2 血液中TIL结果

本研究使用重度免疫缺陷鼠开展研究，所检测的T淋巴细胞主要来源于产品中T细胞，其水平可反映TIL在NOG小鼠体内的增殖情况，同时CD4+和CD8+T细胞在肿瘤杀伤过程中发挥着重要的作用[17]，因此检测CD4+和CD8+T细胞也可反映TIL的杀伤效果和效果持久性。结果显示，首次给药后24 h和末次给药后24 h CD3+、CD3+CD4+细胞在血液中均达到高峰点，首次给药后24 h和末次给药后6 d CD3+CD8+细胞水平达到峰值，至恢复期结束，3种细胞均达到最低(细胞数量几乎为零)，说明末次给药后29 d，TIL已基本在NOG小鼠血液中清除，提示TIL在小鼠体内存续时间较短。在一项治疗肺癌的临床试验中，患者清淋后输入TIL，在给药后1周外周血中CD4+T和CD8+T细胞明显增加，但随着时间的延长，CD4+T和CD8+T细胞比例逐渐下降，后续未见细胞数量增加[18]，其结果显示TIL给药后，前期细胞数量增加明显，后基本在血液中清除，本实验结果与文献报道一致。

TIL主要依靠CD4+、CD8+T细胞以及细胞杀伤因子来抑制、裂解肿瘤细胞，其中CD8+T细胞可以识别肿瘤抗原，从而刺激肿瘤浸润淋巴细胞的活化和增殖，故在肿瘤细胞存在的情况下，肿瘤浸润淋巴细胞可能会更好地发挥生物学活性。本实验未能在荷瘤小鼠模型体内开展研究，TIL发挥的生物学活性有限，无法完全模拟人体对该产品的反应，另外本研究仅采用流式细胞术检测血液中细胞的动态变化过程，并未对小鼠脏器中细胞的分布和增殖情况进行检测，无法评价产品在脏器内的存续时间。基于以上，建议在开展后续实验时，根据产品作用机制和自身特点，选择更合适的动物种属进行毒性评价，同时采用多种方法检测细胞在动物体内的药代动力学特征。

4.3 研究的不足

因本实验未能在荷瘤小鼠体内开展研究，故无法了解TIL在抗原存在情况下的扩增和存续情况，但在临床使用时，TIL因长期在体外扩增而耗竭，也会促使T细胞分化及其表型发生变化，在患者体内表现出较差的细胞毒性和持久性[5，19]，从而影响TIL抗肿瘤效果。目前，针对上述问题有学者进行了TIL制备工艺的优化，例如Hall等[20]从人类胰腺肿瘤中分离出TIL，在培养时加入抗PD-1(程序性死亡受体1)抗体或4-1BB激动剂，TIL增殖数量显著增加，特异性T细胞数量也显著增加。该方法可在较短时间内培养出足够的TIL回输数量，可为减少TIL体外耗竭提供借鉴。另外，也有研究使用基因编辑技术将PD-1和PD-L1联合敲除，可以提高TIL对肿瘤细胞的杀伤能力，同时能够增加促炎细胞因子(如IFN-γ和TNF-α)的分泌[21]。

综上，本研究使用非荷瘤重度免疫缺陷鼠评价了TIL的重复给药毒性风险，研究结果显示，TIL重复尾静脉给予NOG小鼠3次，小鼠未见明显的毒性反应，且在给药后29 d，TIL基本在NOG小鼠血液中清除。本研究数据可支持TIL临床试验注册申请，目前该产品已获得临床批件，可开展临床试验。

表3TIL对NOG小鼠摄食量的影响(g，

表4TIL对雄性NOG小鼠血液学指标的影响

表5TIL对NOG小鼠血清生化指标的影响

参考文献:

[5]杨涵,陈超,王冲.肿瘤浸润性淋巴细胞免疫治疗的研究进展[J].上海医药,2022,43(11):17-21.

[7]翟婧,严婷,伍奕,等.EGFR-TKI与免疫检查点抑制剂在非小细胞肺癌中序贯使用引起毒副反应的研究进展[J].中南药学,2023,21(7):1865-1870.

[14]文海若,黄瑛,屈哲,等.治疗非霍奇金淋巴瘤的嵌合抗原受体T细胞临床前毒性评价[J].中国药物警戒,2022,19(8):828-835.

基金资助:国家重点研发计划课题“干细胞产品非临床有效性和安全性评价新技术及规范研究”(No.2021YFA1101602); 中国食品药品检定研究院关键技术研究基金(No.GJJS-2022-6-1);

文章来源:侯田田,周足力,王涛,等.肿瘤浸润淋巴细胞在重度免疫缺陷小鼠体内毒性研究[J].中南药学,2024,22(09):2292-2299.