首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 肿瘤科论文 > 肿瘤细胞论文 > miR-143-5p通过靶向PD-1表达对宫颈癌细胞增殖和侵袭的影响

miR-143-5p通过靶向PD-1表达对宫颈癌细胞增殖和侵袭的影响

2024-10-24 51 上传者：管理员

摘要：目的探究微小RNA(miR)-143-5p在调节宫颈癌细胞增殖和侵袭中的作用机制。方法收集宫颈癌组织、癌旁非肿瘤组织和正常对照组织各50例。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-143-5p和PDCD1 mRNA表达；Western印迹检测程序性细胞死亡(PD)-1蛋白表达；荧光素酶报告基因验证miR-143-5p对PD-1的直接靶向作用；噻唑蓝(MTT)测定细胞增殖能力；Transwell测定评估细胞侵袭。结果 miR-143-5p表达在宫颈癌标本中显著减少，PD-1蛋白表达在宫颈癌组织中显著增加(P<0.05)。miR-143-5p mimics组细胞增殖显著低于miR-NC组(P<0.05),而miR-143-5p inhibitor组细胞增殖显著高于inhibitor-NC组(P<0.05)。宫颈癌细胞侵袭能力在转染miR-143-5p mimics时显著下调，而在转染miR-143-5p inhibitor时显著上调(P<0.05)。转染pcDNA3.1/PD-1质粒后，miR-143-5p降低的PD-1 mRNA和蛋白表达显著上调(P<0.05)。结论 miR-143-5p在宫颈癌中表达水平下降，并可能通过靶向PD-1调节宫颈癌细胞的增殖和侵袭能力。

关键词：
侵袭
增殖
宫颈癌
微小RNA(miR)-143-5p
程序性细胞死亡(PD)-1
加入收藏

宫颈癌是所有国家中导致妇女发病和死亡的常见癌症类型之一，在乳腺癌、结肠直肠癌和肺癌之后居第四位[1]。2020年全球新发宫颈癌病例60.41万例，死亡人数34.18万例[2]。尽管推荐了宫颈癌筛查项目，但近年来其发病率和死亡率一直在稳步增长。尽管在临床实践中，手术、化疗和放疗应用于不同临床阶段的宫颈癌患者，但经过标准治疗后，一些患者的预后仍然很差[3]。

许多宫颈癌患者可能遭受不可预测的复发、转移和死亡风险。通过长期的临床医学研究发现，宫颈癌的发生和发展与癌细胞的增殖、侵袭和迁移密切相关[4]。淋巴结转移是宫颈癌转移中最常见的现象，是宫颈癌预后不良的独立危险因素。人乳头瘤病毒(HPV)感染和患者免疫退化被证实与宫颈癌的发病机制有关[5,6]。最近，免疫疗法已经改变了许多实体肿瘤的治疗，并在不断发展。2018年，美国食品药品监督管理局批准程序性细胞死亡(PD)-1抑制剂pembrolizumab用于肿瘤表达PD-配体(L)1[联合阳性评分(CPS)≥1]且化疗后疾病进展的复发性或转移性宫颈癌患者[7]。尽管如此，存活率并没有显著提高，尤其是患有持续性、复发性或转移性疾病的妇女的预后仍然很差。因此，有必要在免疫疗法的基础上，进一步调控PD-1和PD-L1的表达以开发新的治疗靶点和治疗方法。

近年来，国内外研究者一致认为微小RNA(miRNAs, miR)在细胞周期中起作用。已有验证证实，miRNAs水平的失调，在宫颈癌发展的几个阶段中对细胞转化起重要作用，对癌症发生、发展和预后发挥了重要的调节功能[8]。miRNAs是长度为19～25个核苷酸的小RNA分子，可以与其靶基因的mRNA的3′-未翻译区(UTR)结合，导致翻译抑制，进而调节基因表达[9]。其中，miR-143-5p已发现与多种癌症相关，包括鼻咽癌、宫颈癌等[10,11],然而miR-143-5p是否靶向调控PD-1表达参与宫颈癌进程尚未可知。本研究探讨miR-143-5p在宫颈癌细胞增殖、侵袭中的作用，并初步探讨其分子机制。

1、材料与方法

1.1患者和样本

收集2020年12月至2021年10月新疆医科大学第一附属医院50例手术患者宫颈癌组织和癌旁正常组织标本，置于液氮保存。另外收集年龄(55～70岁)、性别匹配且因手术切除的50例正常组织。收集所有患者临床资料信息。见表1。标本收集和使用均获得伦理委员会批准(伦理审批号：K202207-03),患者知晓并签署知情同意书。

1.2细胞培养

宫颈癌细胞HeLa和SiHa由新疆医科大学生物样本库提供，在补充有1%青霉素/链霉素(Invitrogen, CA)和10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640(Invitrogen, CA)中于37℃、5%CO2条件下培养。并每2～3 d使用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化后进行传代培养。

表1宫颈癌组织和正常组织的临床特征(n=50)

1.3转染miR-143-5p mimics和miR-143-5p抑制剂

取对数生长期细胞接种于6孔板，使用miRNA转染试剂(百代，江苏)将miR-143-5p mimics、抑制剂、mimics阴性对照(miR-NC)和抑制剂阴性对照(inhibitor-NC,上海吉玛，中国)转染至HeLa和SiHa。转染后48 h裂解细胞，收集RNA和蛋白分别进行下一步检测。

1.4质粒构建

将含有3′-UTR的PDCD1 cDNA插入pcDNA3.1(+)以产生重组载体pcDNA3.1(+)/PDCD1。通过直接测序验证序列的正确性。使用Lipofectamine2000(Invitrogen, CA)转染至HeLa和SiHa中。

1.5荧光素酶报告基因测定

从正常人基因组DNA的序列中扩增PDCD1 3'-UTR,并亚克隆到pGL3荧光素酶报告载体(Promega,美国)中。使用Lipofectamine2000将野生型(WT)或突变体(MUT) 3′-UTR载体和miR-143-5p mimics或miR-NC共转染至HeLa和SiHa中。然后使用双荧光素酶报告分析系统(Promega,美国)检测荧光素酶报告基因活性。

1.6实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)

通过Trizol(Invitrogen,美国)提取组织或细胞的总RNA。利用Quant Reverse试剂盒(天根，中国)转录成cDNA。PDCD1和GAPDH使用通用引物，miR-143和U6使用特定引物通过Quant Reverse试剂盒(天根，中国)进行逆转录反应。PDCD1和GAPDH使用SYBR Premix Ex Tag Kit(天根，中国)进行qRT-PCR,miR-143和U6使用HairpinitTMmiRNAs qPCR试剂盒(上海吉玛，中国)进行qRT-PCR。引物序列：GAPDH正向：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′,反向：5′-AGCCTTCTCCAGGTGGTG-AAGAC-3′;PDCD1正向：5′-AAAGGGAAGGTTGCTGGATA-3′,反向：5′-CAAAGGAACTGTAGATTGTGTGC-3′;miR-143-5p正向：5′-CGCTCTCTCCCAACCCTTGTACC-3′,反向：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;U6正向：5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATTGGAAC-3′,反向：5′-GCTTCACGAATTTGCG-TGTCATCCTTGC-3′。GAPDH和U6分别为内参基因，采用2-△△Ct法计算目标基因的相对表达水平。

1.7 Western印迹法

通过放射免疫沉淀(RIPA)裂解缓冲液(碧云天，南京)提取组织或细胞中的总蛋白。通过使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白质测定试剂盒(碧云天，南京)测定每个样品的蛋白质浓度后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE,10%丙烯酰胺凝胶)分离等量的蛋白质。将分离的蛋白质转印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在脱脂乳中封闭孵育2 h。将膜与抗PD-1抗体和抗 β-肌动蛋白(actin)抗体于4℃中孵育过夜。再将膜与二抗孵育后在显色液中显影蛋白条带。ImageJ软件用来计算蛋白的相对表达。

1.8细胞增殖试验

将HeLa以2.5×103个的数量接种到96孔板中，SiHa细胞以每孔3.0×103个接种到96孔板中。在0、24、48、72、96 h进行噻唑蓝(MTT)测定。

1.9细胞侵袭测定

Transwell小室涂有基质胶(BD Biosciences,美国)以形成基质屏障。然后，将含有1.0×105个HeLa或SiHa的200μl无血清培养基置于上层小室中。在下层小室中加入500μl含有15%胎牛血清(FBS)的培养基。将细胞孵育48 h后取出、固定、染色，显微镜下随机选取视野拍照计数。

1.10统计学分析

采用SPSS21.0软件进行t检验、χ2检验、Fisher精确检验。

2、结果

2.1宫颈癌组组织中miR-143-5p及PD-1mRNA表达

与癌旁非肿瘤组织及正常组织相比，宫颈癌组织中miR-143-5p mRNA表达显著降低，PD-1 mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.05)。见表2、图1。

表2各组织中miR-143-5p及PD-1 mRNA表达

图1各组PD-1蛋白表达

2.2 miR-143-5p的作用靶点预测及验证

miRDB和TargetScan数据库分析发现，PD-1的3′-UTR是miR-143-5p的直接靶标，见图2。miR-143-5p mimics或miR-143-5p抑制剂转染HeLa和SiHa后，miR-143-5p表达变化显著(P<0.05)。转染miR-143-5p mimics后HeLa和SiHa中PD-1 mRNA和蛋白表达显著降低，转染miR-143-5p抑制剂后HeLa和SiHa中PD-1 mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.05)。与两种细胞miR-143-5p mimics NC组比较，两种细胞WT和miR-143-5p mimics共转染组的荧光素酶活性显著降低(均P<0.05)。见图1、表3、表4。

2.3 miR-143-5p对HeLa和SiHa细胞增殖和侵袭的影响

miR-143-5p mimics组细胞增殖能力显著低于miR-NC组，而miR-143-5p抑制剂组细胞增殖能力显著高于inhibitor-NC组(P<0.05)。宫颈癌细胞的侵袭能力在转染miR-143-5p mimics时显著下降，而在转染miR-143-5p抑制剂时显著升高(P<0.05),HeLa和SiHa表现出相似的细胞迁移趋势。见表5、图3、表6。

图2 TargetScan数据库预测miR-143-5p与PD-1的靶向结合位点

表3双荧光素酶报告系统检测miR-143-5p与PD-1的靶向结合

表4 HeLa和SiHa细胞转染miR-143-5p mimics或miR-143-5p抑制剂后miR-143-5p和PD-1 mRNA表达水平

表5 miR-143-5p对Hela和SiHa细胞增殖能力的影响

图3 miR-143-5p对HeLa和SiHa细胞侵袭能力的影响(结晶紫染色，×40)

表6 miR-143-5p对HeLa和SiHa细胞侵袭能力的影响

2.4 PD-1介导miR-143-5p调节宫颈癌细胞的作用

转染pcDNA3.1/PD-1质粒后，miR-143-5p降低的PD-1 mRNA和蛋白水平显著上调，与miR-143-5p mimic组相比，miR-143-5p+pcDNA3.1/PD-1组细胞增殖能力显著升高(P<0.05)。与miR-143-5p mimic组相比，miR-143-5p+pcDNA3.1/PD-1组细胞侵袭数目显著升高(P<0.05)。见图4、表7、表8、图5。

图4转染miR-143-5p mimics和pcDNA3.1/PD-1质粒后PD-1蛋白表达

1～3:miR-NC组、miR-143-5p mimic组、miR-143-5p+pcDNA3.1/PD-1组

表7转染miR-143-5p mimics和pcDNA3.1/PD-1质粒后SiHa和HeLa中PD-1 mRNA、蛋白表达及细胞侵袭数比较

表8转染miR-143-5p mimics和pcDNA3.1/PD-1质粒后SiHa和Hela细胞增殖能力比较

图5转染miR-143-5p mimics和pcDNA3.1/PD-1质粒后SiHa和HeLa细胞侵袭能力(结晶紫染色，×40)

3、讨论

到目前为止，对宫颈癌发病机制的了解仍然非常有限。虽然靶向蛋白质的新疗法，如抗PD-1、PD-L1和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4的抗体已经在癌症药物治疗和药物开发中开创了一个新时代，但目前研究尚未明确其具体机制[12]。miRNAs靶向PD-1/PD-L1,影响肿瘤对抗PD-L1和抗PD-1抗体的敏感性，参与调控免疫微环境[13,14]。miR-143-5p在肺腺癌、胃癌、前列腺癌组织中下调表达，并发现其抑制细胞周期、增殖和转移的进展[15～17]。然而，miR-143-5p在宫颈癌发生中的潜在作用还不明确。

本研究探讨在miR-143-5p与免疫检查点PD-1的靶向调控作用，并且证明了这种miRNA的肿瘤抑制功能。研究证实，miR-143-5p可以通过负调控宫颈癌中的磷酸化细胞转录因子(ELK)1抑制细胞周期、增殖、迁移和侵袭，但促进凋亡[11]。这与本研究结果一致，即miR-143-5p可能在抑制宫颈癌中发挥重要作用。然而，尚未有更多的研究证实miR-143-5p在宫颈癌中的作用，尤其是miR-143-5p与PD-1之间的靶向调控关系。生物信息学网站Targetscan预测miR-143-5p和PD-1之间存在结合位点，且双荧光素酶报告检测证实了二者之间的靶向结合。PD-1在广泛的肿瘤细胞中表达[18]。PD-1充当肿瘤细胞通过逃避T细胞杀伤而存活的介质，当活化的T细胞和肿瘤细胞通过PD-1/PD-L1轴相互结合时，活化的T细胞功能被抑制，最终导致肿瘤免疫逃逸。PD-1/PD-L1通路靶向免疫治疗在多种实体瘤患者中显示出明显的抗肿瘤效果[19]。针对PD-1/PD-L1途径的抗体已被广泛应用于宫颈癌的病例，在复发和(或)转移性宫颈癌患者中显示出有希望和持久的临床活性[20]。

本研究结果证实了miR-143-5p和PD-1在宫颈癌患者中的表达及对细胞增殖、迁移和侵袭的潜在作用。但仍然需要更多的临床证据来阐明miR-143-5p和PD-1在宫颈癌中用作特异性和敏感的非侵入性生物标志物的作用。

综上，miR-143-5p在宫颈癌组织中低表达，并通过直接靶向PD-1表达，在体外抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭。因此，miR-143-5p可作为预测和治疗宫颈癌的潜在靶点。

基金资助:省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室开放课题资助项目(SKL-HIDCA-2020-JZ8);

文章来源:王华芳,迪丽达尔·斯地克,索龙格,等.miR-143-5p通过靶向PD-1表达对宫颈癌细胞增殖和侵袭的影响[J].中国老年学杂志,2024,44(20):5016-5021.