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植物来源的miR-2096-3P靶向调节TAF15对肝癌细胞恶性生物学行为影响

2025-02-08 51 上传者：管理员

摘要：目的分析植物水稻来源的微小RNA-2096-3P(miR-2096-3P)靶向调节TATA框结合蛋白相关因子(TAF)15对肝癌细胞恶性生物学行为的影响。方法对正常肝细胞及肝癌细胞miR-2096-3P、TAF15 mRNA表达量进行检测，将HepG2细胞分为miR-NC组(转染miR-2096-3P阴性对照)、miR-2096-3P组(转染miR-2096-3P过表达质粒)、miR-2096-3P+TAF15-NC组(转染miR-2096-3P过表达质粒+TAF15阴性对照)、miR-2096-3P+TAF15组(转染miR-2096-3P过表达质粒+TAF15过表达质粒),培养48 h后检测细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭情况。结果与正常肝细胞QSG-7701相比，肝癌细胞QGY、SMMC7721、HepG2TAF15 mRNA表达量显著升高(P<0.05);与肝癌细胞QGY、SMMC7721相比，肝癌细胞HepG2TAF15 mRNA表达量显著升高(P<0.05),故需选择肝癌细胞HepG2进行后续实验。miR-2096-3P组miR-2096-3P、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、髓细胞瘤病毒致癌基因(c-myc)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表达量、增殖活性、迁移数、侵袭数低于miR-NC组，凋亡率、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)明显高于miR-NC组(P<0.05)。双荧光素酶报告系统结果显示，与osa-miR-NC组相比，osa-miR2096-3p组野生型WT-TAF15的荧光素酶相对活性显著降低(P<0.05)。与osa-miR-NC组相比，osa-miR-2096-3P组TAF15、FASN蛋白表达量显著降低(P<0.05)。osa-miR-2096-3P+TAF15组TAF15、Bcl-2、c-myc、MMP-2、MMP-9表达量、增殖活性、迁移数、侵袭数明显高于osa-miR-2096-3P+TAF15-vector组，凋亡率、Bax、PARP显著低于osa-miR-2096-3P+vector组(P<0.05)。结论植物水稻来源的miR-2096-3P可通过靶向调节TAF15而降低肝癌细胞增殖率，抑制迁移、侵袭，促进凋亡。

关键词：
TATA框结合蛋白相关因子15
微小RNA-2096-3P
恶性生物学行为
植物水稻来源
肝癌
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肝癌是由慢性感染、过度饮酒、长期食用霉变食物等因素引发的常见恶性肿瘤，其具有特征不明确、陈辉等植物来源的miＲ-2096-3P靶向调节TAF15对肝癌细胞恶性生物学行为的影响第3期 ·673·诊断难度大、恶性程度高等特点，临床治疗以放化疗、手术切除、介入治疗为主，但整体疗效并不理想〔1～3〕。肝癌的发生、发展包含细胞、分子、组织等方面变化，包含变异细胞免疫逃逸增强、细胞微环境变化等，故从寻找分子层面明确肝癌发病机制、治疗方法具有重要意义〔4～8〕。TATA框结合蛋白相关因子( TAF) 15可参与ＲNA剪接及运输、mＲNA转录，为TET家族重要成员。miＲNA在细胞发育、分化、代谢、胚胎发育等多种生物过程中均发挥着重要作用，在大豆、玉米、水稻、马铃薯等植物基因组中分布较为广泛，而miＲ2096-3P为重要的miＲNA，但其在肝癌中的作用尚未明确〔9～13〕。基于此，本研究分析了植物水稻来源的miＲ-2096-3P靶向调节TAF15对肝癌细胞恶性生物学行为的影响，以为靶向治疗肝癌提供借鉴。

1、对象与方法

1. 1细胞、试剂与仪器

质子泵基因-微小ＲNA2096-3P( osa-miＲ-2096-3P)〔微元合成生物技术(北京)有限公司〕; QSG-7701、QGY、SMMC7721、HepG2细胞(北京博沃尔斯生物科技) ;ＲPMI1640培养液(浙江吉诺赛百尔生物科技) ; Trizol试剂(南京诺唯赞生物科技) ; MTT试剂(武汉伊莱瑞特生物科技) ;二甲基亚砜( DMSO) (西安百萤生物科技) ; TUNEL试剂盒(武汉博士德生物工程) ;磷酸盐缓冲液( PBS)(北京兴怡雅创生物技术) ;结晶紫试剂(上海源叶生物科技) ;显微镜〔仪景通光学科技(上海)〕; TAF15沉默质粒、过表达质粒(温州科淼生物科技) ;分离胶、浓缩凝胶(上海甄准生物科技) ;蛋白电泳仪(上海易汇生物科技) ; B细胞淋巴瘤( Bcl) -2相关X蛋白( Bax)、活化的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶( PAＲP)、Bcl-2、髓细胞瘤病毒致癌基因( c-myc)、基质金属蛋白酶( MMP) -2、MMP-9、TAF15、脂肪酸合酶( FASN)一抗、二抗(北京百奥莱博科技)。

1. 2细胞培养及转染

将肝癌细胞HepG2置于ＲPMI1640培养液(包含链霉素100 mg /L、青霉素100 U/ml、10%PBS)培养( 5% CO2，37℃)，培养液每2 d更换1次，待细胞融合度达80%后分组转染，分为miＲ-NC组(转染miＲ-2096-3P阴性对照)、miＲ-2096-3P组(转染miＲ-2096-3P过表达质粒)、osa-miＲ-2096-3P+vector组(转染miＲ-2096-3P过表达质粒+TAF15阴性对照)、osa-miＲ-2096-3P+TAF15组(转染miＲ-2096-3P过表达质粒+TAF15过表达质粒)，继续培养48 h后进行后续检测。

1. 3实时荧光定量-聚合酶链反应(ＲT-PCＲ)法检测

miＲ-2096-3P、TAF15 mＲNA表达量通过Trizol试剂进行提取细胞中总ＲNA，总ＲNA纯度、浓度通过超微量核酸蛋白检测仪进行测量，后合成总cDNA，以cDNA为模板U6为内参，采用Primer5. 0软件设计引物序列，启动PCＲ仪，进行扩增，采用2－ΔΔCt方法计算出细胞miＲ-2096-3P、TAF15 mＲNA表达量。试验重复测量3次。

1. 4 MTT法检测细胞增殖率

取各组HepG2细胞，置于96孔板中( 2×103个/孔)，同时设立平行复孔3个，后将10μl MTT试剂加入每孔，继续培养4 h( 37℃)，后加入200μl DMSO，孵育30 min( 37℃)，490 nm处A值，即为细胞增殖活性。

1. 5 TUNEL法检测细胞凋亡率

取各组HepG2细胞，接种于96孔板中，固定、处理采用0. 5%TritonX100、4%多聚甲醛进行，后加入TUNEL试剂，采用TUNEL试剂盒在显微镜下取5个视野对4，6-二苯胺-2-苯吲哚二盐酸盐( DAPI)、TUNEL阳性染色细胞进行计数，获取凋亡率。

1. 6划痕实验检测细胞迁移数

取各组HepG2细胞，置于24孔板中( 1×105个/孔)，培养24 h后将上清去除，进行划痕，后采用PBS清洗，共3次，再加入无血清培养基，继续培养( 5% CO2，37℃)，在光镜下对细胞分布状态进行观察、拍照并记数。

1. 7 Transwell小室实验检测细胞侵袭数

取各组HepG2细胞，上室、下室中分别加入100μl单核细胞悬液、含600μl 20%PBS培养液，培养24 h后取出上室液，去除下室液，采用PBS清洗、4%多聚甲醛固定、0. 5%结晶紫溶液染色，显微镜下观察、拍照并进行侵袭计数。

1. 8 Western印迹法检测

增殖、凋亡、迁移、侵袭相关蛋白表达量收集各组HepG2细胞，置入裂解液，离心(转速1 000 r/min、4℃) 15 min，获取上清(总蛋白)，经二喹啉甲酸( BCA)法检测蛋白浓度，获得蛋白样品40μg，经分离胶、浓缩凝胶电泳后移至聚偏氟乙烯( PVDF)膜，封闭1 h( 37℃)后加入Bax、PAＲP、Bcl-2、c-myc、MMP-2、MMP-9、TAF15、FASN一抗稀释液( 1∶1 000)，孵育过夜，洗涤后加入Bax、PAＲP、Bcl-2、c-myc、MMP-2、MMP-9、TAF15、FASN二抗稀释液( 1∶2 000)，再次孵育、洗涤，显影并分析条带灰度值。

1. 9双荧光素酶报告基因检测

采用TargetScanHuman法预测miＲ-2096-3P、TAF15关系，构建野生型载体WT-TAF15，突变型载体MUT-TAF15，分别将osa-miＲNC、osa-miＲ-2096-3P与WT-TAF15、MUTTAF15共转染至293T细胞，培养24 h后对荧光素酶活性进行检测。

1. 10统计学处理

采用SPSS19. 0软件进行t检验、F检验。

2、结果

2. 1正常肝细胞及肝癌细胞

TAF15 mＲNA表达量对比各细胞TAF15 mＲNA差异有统计学意义( F = 20. 631，P＜0. 001)，与正常肝细胞QSG-7701( 1. 10±0. 07)相比，肝癌细胞QGY( 1. 80±0. 09)、SMMC7721( 1. 78±0. 12)、HepG2 TAF15 mＲNA表达量( 2. 36±0. 18)升高，差异具有统计学意义( t =10. 634、8. 478、11. 300，P＜0. 05) ;与肝癌细胞QGY、SMMC7721相比，肝癌细胞HepG2 TAF15 mＲNA表达量升高，差异具有统计学意义( t = 5. 245、5. 390，n = 3，P＜0. 05)，故需选择肝癌细胞HepG2进行后续实验。

2. 2过表达miＲ-2096-3P对HepG2细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

如表1、图1所示，miＲ-2096-3P组miＲ-2096-3P、Bcl-2、c-myc、MMP-2、MMP-9表达量、增殖活性、迁移数、侵袭数低于miＲ-NC组，凋亡率、Bax、PAＲP高于miＲ-NC组，差异具有统计学意义( P＜0. 05)。

表1过表达miＲ-2096-3P对HepG2细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

图1过表达miＲ-2096-3P后HepG2细胞、凋亡、迁移

2. 3双荧光素酶报告实验osa-miＲ-2096-3P靶向TAF15如表2、图2所示，双荧光素酶报告系统结果显示，与osa-miＲ-NC组相比，osa-miＲ-2096-3P组野生型WT-TAF15的荧光素酶相对活性降低，差异具有统计学意义( P＜0. 05)，而突变型MUT-TAF15无显著变化( P＞0. 05)，与osa-miＲ-NC组TAF15( 1．02±0．10)、FASN( 1．01±0．09)蛋白表达量相比，osa-miＲ-2096-3P组TAF15 ( 0．82±0．07 )、FASN( 0．76±0．06)蛋白表达量降低，差异具有统计学意义( t = 2．838、4．003，P＜0．05)。

表2双荧光素酶报告实验

图2双荧光素酶报告实验及osa-miＲ-NC组、osa-miＲ-2096-3P组TAF15、FASN蛋白Western印迹

2. 4过表达TAF15逆转了miＲ-2096-3P对HepG2细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

如表3、图3所示，osa-miＲ-2096-3P + TAF15组TAF15、Bcl-2、cmyc、MMP-2、MMP-9表达量、增殖活性、迁移数、侵袭数高于osa-miＲ-2096-3P +vector组，凋亡率、Bax、PAＲP低于osa-miＲ-2096-3P+vector组，差异具有统计学意义( P＜0. 05)。

表3过表达TAF15逆转了miＲ-2096-3P对HepG2细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

图3过表达TAF15后HepG2细胞凋亡、迁移

3、讨论

有关研究显示〔14～16〕，细胞异常增殖、凋亡受阻为肝癌最主要的恶性生物学特征，受Bax、PAＲP、Bcl-2、c-myc等细胞因子调控。Bax经细胞质转移至线粒体后形成异源二聚体，进而对Bcl-2活性起到了抑制作用，加速了细胞凋亡，而Bcl-2是具有阻止细胞色素C释放、抑制钙离子跨膜流动等作用的抗凋亡蛋白，在多种恶性肿瘤中呈高表达〔17，18〕。PAＲP可经激活天冬氨酸蛋白水解酶( Caspase) -3而降解细胞内的关键蛋白质，启动细胞凋亡，可用于凋亡程度评估〔19〕。c-myc涉及细胞分化、增殖、凋亡、代谢等多个过程，其过表达可促进细胞分裂，使细胞无限增殖，诱发了乳腺癌、肝癌、粒细胞白血病、肺癌等癌症〔20〕。另有研究显示〔21，22〕，肿瘤细胞迁·676· 中国老年学杂志2025年2月第45卷移、侵袭为肿瘤致死的重要原因，其主要原因为肿瘤细胞脱落可进入淋巴管、血管，最终进入器官、组织。细胞外基质降解酶合成为肿瘤迁移、侵袭关键，MMP-2，MMP-9均为MMPs家族成员，属于胶原酶，其水平上升可造成Ⅳ型胶原酶降解，与肿瘤细胞迁移、侵袭能力呈正相关。有关学者发现，过表达TAF15可提升细胞增殖、侵袭能力，恢复恶性表型。本研究表明，miＲ-2096-3P可能通过调控TAF15及下游基因FASN而影响肝癌细胞恶性生物学行为。分析其原因为: TAF15是一种在肿瘤基质中广泛存在的TET家族成员，不仅对蛋白酶类、生长因子分泌具有促进作用，且可改变基质结构，使得癌细胞恶性表型恢复，增殖、迁移、侵袭加速，而FASN为TAF15的下游基因，其高表达同样可增加肿瘤迁移、侵袭风险，被视为典型的致癌蛋白。综上所述，miＲ-2096-3P表达后可经调控TAF15表达影响细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭，为靶向治疗肝癌提供了参考。但本研究仍具有一定的局限性，miＲ-2096-3P可能有多个下游靶基因，且可能涉及其他信号通路，有待进一步体外实验证实。

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基金资助:上海市科技兴农项目(No.2022-02-08-00-12-F01088);

文章来源:陈辉,王佳华.植物来源的miR-2096-3P靶向调节TAF15对肝癌细胞恶性生物学行为的影响[J].中国老年学杂志,2025,45(03):673-677.