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鸢尾素通过调节AMPK/mTOR/ULK1通路对OGD/R诱导神经元损伤影响

2025-02-08 102 上传者：管理员

摘要：目的探讨鸢尾素调节腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/苏氨酸蛋白激酶-失调51样激酶(ULK)1通路对氧糖剥夺与再灌注(OGD/R)诱导的神经元损伤的影响与机制。方法将小鼠海马神经元细胞HT22分为对照组(正常培养的HT22细胞)、OGD/R组、鸢尾素低(12.5 nmol/L)、中(25.0 nmol/L)、高剂量(50.0 nmol/L)组、激活剂组(50.0 nmol/L的鸢尾素+10 nmol/L AMPK激活剂AICAR);噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活情况；流式细胞仪检测细胞凋亡；酶联免疫吸附试验(ELLSA)检测细胞上清液中丙二醛(MDA)水平、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)活性；Western印迹检测细胞中磷酸化(p)-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、ULK1、泛素结合蛋白(p62)、自噬微管相关蛋白轻链(LC)3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)、激活型半胱氨酸蛋白酶(cleved caspase)-3/caspase-3表达。结果与对照组比较，OGD/R组HT22细胞的OD570值、SOD活性、p-mTOR/mTOR、p62表达明显降低，细胞凋亡率、MDA水平和LDH活性、p-AMPK/AMPK、ULK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax、cleved caspase-3/caspase-3表达明显升高(P<0.05);与OGD/R组比较，鸢尾素低、中、高剂量组TH22细胞的OD570值、SOD活性、p-mTOR/mTOR、p62表达显著升高，细胞凋亡率、MDA水平和LDH活性、p-AMPK/AMPK、ULK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax、cleved caspase-3/caspase-3表达明显降低(P<0.05);鸢尾素高剂量处理细胞并加入AMPK的激活剂AICAR后，明显减弱了鸢尾素对HT22细胞增殖的促进作用，细胞自噬和凋亡能力明显增强(P<0.05)。结论鸢尾素可通过调节AMPK/mTOR/ULK1通路介导的自噬减轻OGD/R诱导的神经元损伤。

关键词：
氧糖剥夺与再灌注(OGD/R)
神经元损伤
腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/苏氨酸蛋白激酶-失调51样激酶(ULK)1
自噬
鸢尾素
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脑卒中是严重危害人们生命健康安全的疾病之一，其发病率、致残率和死亡率均较高，而缺血性脑卒中占有其较大比例，能造成脑部神经元不可逆转的损伤〔1〕。缺血性脑卒中，又称脑梗死，是由于脑部血液循环障碍和组织缺血、缺氧导致的脑血管性疾病，其发病机制复杂，自噬、细胞凋亡、炎症反应和细胞坏死等生理过程在脑神经元损伤中起关键作用〔2，3〕，深入探究缺血性脑卒中的发生发展机制意义重大。鸢尾素是一种在运动过程中新发现的骨骼肌衍生肌因子，其具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等生理作用，对心脑血管系统有重要保护作用〔4〕。有研究证实，鸢尾素可减轻氧糖剥夺与再灌注( OGD/Ｒ)诱导的神经元损伤〔5〕。腺苷酸活化蛋白激酶( AMPK) /哺乳动物雷帕霉素靶蛋白( mTOＲ) /苏氨酸蛋白激酶-失调51样激酶( ULK) 1是与自噬相关的信号通路，在缺血性脑卒中进程中发挥重要作用〔6〕。有研究表明，回药木香油方通过AMPK/mTOＲ通路降低ULK1表达，从而抑制OGD/Ｒ诱导的PC12细胞损伤后的自噬〔7〕。但鸢尾素通过调节AMPK/mTOＲ/ULK1通路介导的自噬对OGD/Ｒ诱导的神经元损伤的影响尚不清楚。本研究探讨鸢尾素对OGD/Ｒ诱导的小鼠海马神经元细胞HT22损伤的影响及其可能的作用机制。

1、材料与方法

1. 1实验材料

小鼠海马神经元细胞HT22购自中国细胞资源库保藏中心。

1. 2主要试剂

鸢尾素(货号: P2034)购自美国Phoenix公司; AMPK的激活剂AICAＲ(货号: EY21916)购自上海一研生物科技有限公司;超氧化物歧化酶( SOD )活性检测试剂盒(货号:BC0170)、丙二醛( MDA)含量检测试剂盒(货号:BC0020)、乳酸脱氢酶( LDH)酶联免疫吸附试验( ELISA)试剂盒(货号: BC0685)购自北京索莱宝科技有限公司;兔源一抗p-AMPK (货号:ab133448)、AMPK (货号: ab32047 )、p-mTOＲ(货号: ab109268)、mTOＲ(货号: ab32028)、ULK1 (货号: ab167139 )、泛素结合蛋白( p62 ) (货号:ab109012)、自噬微管相关蛋白轻链( LC3)Ⅱ(货号: ab192890)、LC3Ⅰ(货号: ab52768 )、Beclin-1(货号: ab207612)、B细胞淋巴瘤( Bcl) -2相关X蛋白( Bax，货号: ab32503)、激活型半胱氨酸蛋白酶( cleved caspase) -3(货号: ab2302)、caspase-3(货号: ab32351)购自美国Abcam公司。

1. 3 OGD/Ｒ诱导与分组

将HT22细胞培养液换为无糖培养液，在无氧小室( 37℃、5% CO2、95%N2)培养6 h，复糖氧时，更换为完全培养液，在常规培养箱中复糖氧12 h。把HT22细胞分为对照组、OGD/Ｒ组〔8〕、鸢尾素低、中、高剂量组〔5〕( 12. 5、25. 0、50. 0 nmol /L鸢尾素)、激活剂组〔9〕( 50. 0 nmol /L鸢尾素+ 10 nmol /L AMPK的激活剂AICAＲ)，OGD/Ｒ组在造模6 h后加入完全培养液培养12 h，鸢尾素低、中、高剂量组在造模6 h后分别加入相应浓度的鸢尾素培养12 h，对照组正常培养。

1. 4噻唑蓝( MTT)法

96孔板中接种各组细胞( 1×104个/孔)，分别培养24、48、72 h后，添加MTT溶液培养4 h，再添加二甲基亚砜( DMSO，100 L/孔)反应10 min，检测吸光度( 570 nm波长)。

1. 5流式细胞术

将各组HT22细胞用结合缓冲液( 100μl)悬浮，加入膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素( AnnexinⅤ-FITC)和碘化丙啶( PI)染液(各5μl)避光反应15 min，上机检测细胞凋亡。

1. 6 ELLSA

收集各组细胞培养上清液，检测MDA水平、SOD和LDH活性，按照试剂盒说明书操作。

1. 7 Western印迹

提取各组HT22细胞总蛋白，经定量、电泳分离、转膜、封闭后，将膜在4℃与一抗p-AMPK、AMPK、p-mTOＲ、mTOＲ、ULK1、p62、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax、cleved caspase-3、caspase-3和GAPDH孵育24 h，室温下再与二抗反应2 h，显影，ImageJ软件分析灰度值。

1. 8统计学分析

采用Graphpad Prism7. 0软件进行方差分析、SNK-q检验。

2、结果

2. 1鸢尾素对HT22细胞活力的影响

OGD/Ｒ组细胞活力明显低于对照组( P＜0. 05) ;与OGD/Ｒ组比较，鸢尾素低、中、高剂量组细胞活力明显高于OGD/Ｒ组，且呈明显剂量依赖性( P＜0. 05) ;激活剂组细胞活力明显低于高剂量鸢尾素组( P＜0. 05)，见表1。

2. 2鸢尾素对HT22细胞凋亡的影响

OGD/Ｒ组细胞凋亡率明显高于对照组( P＜0. 05) ;鸢尾素低、中、高剂量组细胞凋亡率明显低于OGD/Ｒ组，且呈明显剂量依赖性( P＜0. 05) ;激活剂组细胞凋亡率明显高于鸢尾素高剂量组( P＜0. 05)，见表1、图1。

2. 3鸢尾素对HT22细胞上清液中MDA水平、SOD和LDH活性的影响

OGD/Ｒ组MDA水平、LDH活性明显高于对照组，SOD活性明显低于对照组( P＜0. 05) ;鸢尾素低、中、高剂量组MDA水平、LDH活性明显低于OGD/Ｒ组，SOD活性明显高于OGD/Ｒ组，且呈明显剂量依赖性( P＜0. 05) ;激活剂组MDA水平、LDH活性明显高于鸢尾素高剂量组，SOD活性明显低于鸢尾素高剂量组( P＜0. 05)，见表1。

表1各组HT22细胞活力、凋亡率及细胞上清液中MDA水平、SOD和LDH活性比较

2. 4鸢尾素对HT22细胞中AMPK/mTOＲ/ULK1通路的影响

OGD/Ｒ组p-AMPK/AMPK、ULK1表达明显高于对照组，p-mTOＲ/mTOＲ表达明显低于对照组( P＜0. 05 ) ;鸢尾素低、中、高剂量组pAMPK/AMPK、ULK1表达明显低于OGD/Ｒ组，pmTOＲ/mTOＲ表达高于OGD/Ｒ组，且呈明显剂量依赖性( P＜0. 05 ) ;激活剂组p-AMPK/AMPK、ULK1表达明显高于鸢尾素高剂量组，p-mTOＲ/ mTOＲ表达明显低于鸢尾素高剂量组( P＜0. 05)，见图2、表2。

2. 5鸢尾素对HT22细胞中自噬和凋亡相关蛋白表达的影响

OGD/Ｒ组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax、cleved caspase-3/caspase-3表达明显高于对照组，p62表达明显低于对照组( P＜0. 05) ;鸢尾素低、中、高剂量组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax、clevedcaspase-3/caspase-3表达明显低于OGD/Ｒ组，p62表达明显高于OGD/Ｒ组，且呈明显剂量依赖性( P＜0. 05) ;激活剂组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax、clevedcaspase-3/caspase-3表达明显高于鸢尾素高剂量组，p62表达水平明显低于鸢尾素高剂量组( P＜0. 05)，见图2、表2。

图1各组HT22细胞凋亡1～6:对照组、OGD/Ｒ组、鸢尾素低、中、高剂量组、激活剂组

图2各组HT22细胞中AMPK/mTOＲ/ULK1通路及自噬和凋亡相关蛋白表达

表2各组HT22细胞中AMPK/mTOＲ/ULK1通路相关蛋白及自噬和凋亡相关蛋白表达比较

3、讨论

由于人们生活方式和习惯的改变及生活压力的增高，缺血性脑卒中的发病率逐年升高，并且其发病进程较快，如果患者不能得到有效及时的治疗，将会致残甚至死亡〔10〕。大脑海马区极易因缺血再灌注受损，因此，深入探寻海马区神经元损伤的保护机制至关重要。建立OGD/Ｒ模型是研究脑缺血/再灌注损伤的主要方法，通过氧糖剥夺模拟脑神经缺血下细胞缺糖缺氧条件，复糖复氧模拟再灌注环境〔11〕。本研究结果提示，OGD/Ｒ诱导可抑制HT22细胞增殖，促进其凋亡。MDA是脂质过氧化产物，其具有细胞毒性，MDA含量较多表明机体脂质过氧化程度加深〔12〕。SOD是一种抗氧化酶，调控机体氧化和抗氧化平衡〔13〕。LDH是无氧糖酵解的最终产物，组织坏死或受外界刺激损伤可使LDH活力增高〔14〕。自噬对缺血性脑卒中病理变化至关重要，在大脑细胞稳态中扮演重要角色〔15〕。在自噬形成过程中LC3Ⅰ转变为LC3Ⅱ，Beclin-1与自噬体形成有关，p62可通过介导多种信号通路参与自噬〔16〕。本研究结果提示，OGD/Ｒ诱导可引起HT22细胞的自噬和损伤。鸢尾素来源于含有纤连蛋白Ⅲ型结构域5的裂解，对线粒体功能障碍、氧化应激、代谢失衡、能量消耗等各种生理过程有重大影响，另外其还具有神经保护作用〔17〕。

有研究表明，鸢尾素可通过调节Notch信号通路从而缓解短暂的全脑缺血/再灌注神经损伤〔18〕。本研究结果提示，鸢尾素可减轻OGD/Ｒ诱导的HT22细胞损伤。AMPK/mTOＲ/ULK1是参与细胞自噬的重要途径，AMPK是触发自噬的主要调节因子，当能量缺乏时其被活化，抑制mTOＲ，可直接磷酸化ULK1，促进自噬发生〔19〕。研究证实，补阳还五汤通过介导AMPK/mTOＲ/ULK1信号通路抑制细胞自噬，从而对脑缺血/再灌注大鼠神经损伤发挥保护作用〔20〕。本研究证实了鸢尾素可以通过调节AMPK/mTOＲ/ULK1通路介导的自噬减轻OGD/Ｒ诱导的神经元损伤。然而，本研究尚存在不足之处，仅仅在细胞水平上验证了鸢尾素调控AMPK/mTOＲ/ULK1通路介导的自噬对HT22细胞增殖、凋亡、自噬和氧化应激的影响，并未在体内水平上进行探讨，后续研究将会在体内水平上进行进一步探索。

参考文献:

8袁美玲,张云,王艳,等.羟基红花红色素A抑制氧化应激和细胞凋亡改善OGD/R诱导的HT22细胞损伤〔J〕.中南药学,2022;20( 1) : 1-7.

9秦力,梁馨予,顾业芸,等.二氢杨梅素激活磷酸腺苷活化蛋白激酶抑制高糖诱导的血管内皮细胞凋亡〔J〕.第三军医大学学报,2016; 38( 7) : 675-80.

文章来源:高远,李艳,杜洪洋,等.鸢尾素通过调节AMPK/mTOR/ULK1通路对OGD/R诱导神经元损伤的影响及机制[J].中国老年学杂志,2025,45(03):721-725.