甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤,其发病率在全球范围内呈上升趋势,其中分化型甲状腺癌(DTC)约占所有甲状腺癌病例的90%[1]。传统化疗药物对甲状腺肿瘤疗效普遍不显著,目前手术治疗仍是甲状腺肿瘤患者的首选治疗方式[2]。中药,特别是复方中药,对肿瘤的作用是多途径、多靶点的,对肿瘤和机体免疫功能均有影响。QinJH等[3]指出中医药已广泛应用于亚洲各种疾病的预防和治疗中,其研究也证实了黄芪扶正汤可以通过多靶点抑制骨肉瘤细胞增殖,诱导其凋亡,并减少顺铂的副作用。黄芪扶正汤作为我国中医传统经验方剂,主要由黄芪、黄精、灵芝、女贞子以及枸杞等组成,这五味复方中药均有不同程度提高免疫力、抑制肿瘤生长的作用[4]。但目前,尚未见黄芪扶正汤针对细胞周期素依赖性激酶(CDKs)或CyclinD、视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)通路研究其抗甲状腺肿瘤机制的研究,因此,本研究采用体外细胞培养研究法,分析其抗肿瘤的具体机制,旨在为中医黄芪扶正汤的抗肿瘤治疗提供有力的实验证据。

1、材料与方法

1.1试剂

人甲状腺乳头状癌细胞株TPC-1(购于上海富衡生物科技有限公司);胎牛血清(美国FoundationMedicine公司);无血清DMEM、1640培养基、1640完全培养基及DMEM完全培养基(美国HyClone公司);无菌PBS及胰酶(福州生物科技有限公司);4-甲偶氮唑蓝(MTT)试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);碘化丙啶(PI)(南京诺唯赞生物科技有限公司);10mg/mlRnaseA(厦门安提海拉生物科技有限公司);细胞凋亡检测试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司);引物RB1-QF、RB1-QR、CDK4-QF、CDK4-QR(厦门安提海拉生物科技有限公司);RNAIsolaterTotalRNAExtractionReagent试剂盒、HiScriptⅡQRTSuperMixforqPCR试剂盒、ChamQSYBRqPCRMasterMix试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)等。

1.2药物

黄芪扶正汤(具体组方为:黄芪30g、枸杞15g、灵芝粉15g、黄精15g、女贞子15g),同一批次统一购于本院中药房。按黄芪扶正汤方的配方称取药材共90g,加10倍量的水浸泡30min后,武火加热煮沸,煮沸后改用文火煮沸1h,纱布过滤,残渣加水8倍量后重新煎煮一遍,过滤,合并滤液,减压回收溶剂,最后浓缩至60ml,即原生药浓度为1.5g/ml,放冰箱备用。

1.3仪器

CO2培养箱酶标仪(HEALFORCE公司)CO2培养箱离心机(HEALFORCE湘仪公司);高速冷冻离心机(BBI公司,型号为HC-3018R);PCR仪(西安天隆科技公司,型号为GENESY-96T);实时荧光定量PCR仪(美国应用生物,型号为ABI7300plus);微型台式真空泵(其林贝尔公司,型号为GL-802)。

1.4MTT法检测各组细胞增殖情况及半抑制浓度(IC50)

接种细胞:用含10%胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000～10000个细胞的密度接种到96孔板中,每孔体积100μl。加药:用培养基配制不同浓度梯度的黄芪扶正汤(20.0g/L、10.0g/L、5.0g/L、2.0g/L、1.0g/L、0.0g/L),每孔加入100μl。培养细胞:同一般培养条件,培养1～2d(可根据试验目的和要求决定培养时间)。呈色:培养1～2d后,每孔加MTT溶液(5mg/ml)20μl。继续孵育4h,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150μl二甲基亚砜(DMSO),振荡10min,使结晶物充分融解。比色:选择490nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔的光密度值,记录结果,以浓度为横坐标,光密度值为纵坐标来绘制细胞生长曲线。

1.5流式细胞术检测细胞周期情况

处理细胞:以不用药物浓度对照组(0g/L)及实验组(6g/L)(IC50最优剂量为6.118g/L,为方便计算,用6g/L浓度干预)处理细胞,继续培养24～48h。固定:消化下细胞,离心,PBS清洗1遍,300μlPBS重悬细胞,再加入900μl预冷的无水乙醇迅速混匀。4℃固定4h或者过夜,可长期保存在-20℃。透膜:以300g,5min离心,PBS洗1次。用990μl含0.2%Tritonx-100的PBS重悬细胞,同时加入10μl100mg/mlRnaseA,混匀后置于37℃中30min。染色:以300g,5min离心,PBS洗1次。重悬细胞,浓度1×106个/100μl为宜。加入PI,4℃染色30min或室温10min。上机。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡情况

处理细胞:黄芪扶正汤以不同浓度(0g/L、6g/L浓度)处理TCP-1细胞,继续培养24～48h。收集细胞:用不含EDTA的胰酶消化细胞,同时收集培养基和清洗细胞的PBS中的细胞。4℃,300g离心5min。染色:PBS清洗1次,4℃,300g离心5min。100μl染色缓冲液重悬细胞,加入5μlAnexinV-FITC和5μlPI染色液,室温反应10min。上机。

1.7实时荧光定量PCR(qPCR)法检测细胞Rb、CDK4mRNA的表达情况

总RNA抽提:按RNAIsolater总RNA提取试剂盒说明书抽提,将样本破碎和匀浆:用PBS洗涤一次培养液,每10cm2培养面积的细胞加入1mlRNAisolater,用移液器将细胞吹打下来,将裂解液转移至1.5ml离心管中,用移液器反复吹打直至无明显颗粒样存在,冰上静置5min后提取RNA。反转录获得cDNA:按HiScriptⅡQRTSuperMixforqPCR试剂盒说明书操作,在RNase-free的离心管中配置4xgDNAwiperMix4μl,总RNA1μg,RNasefreeddH2O,共16μl;用移液器轻轻吹打混匀,42℃2min。在以上的反应液中加入5xHiScriptⅡqRTSuperMixⅡ4μl进行逆转录反应合成cDNA。qPCR检测对照组和实验组细胞Rb及CDK4mRNA相对表达量:按ChamQSYBRqPCRMasterMix试剂盒说明书操作,在PCR管中配制总体积为20μl的PCR反应体系:2×ChamQSYBRqPCRMasterMix,10μmol/L的上、下游引物、50xROXReferenceDye1,cDNA和ddH2O(反应体系中各成分的量可根据原则自行调整)。按95℃预变性30s;40个循环反应,95℃反应10s,60℃反应30s进行qPCR反应。以18sRNA为内参,以2-△△Ct法计算对照组和实验组细胞Rb及CDK4mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1引物序列

1.8统计学方法

实验数据采用SPSS20.0进行统计学分析,计数资料以率(%)表示,组间比较采用χ2检验;计量资料以(x¯±s)表示,组间比较采用t检验;统计结果采用GraphPadPrism5软件作图。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1黄芪扶正汤对人TPC-1细胞增殖的影响

取对数期TPC-1细胞,经对照组(0g/L)及不同剂量实验组(0.5、1.0、2.5、5、10g/L)处理后,对照组的细胞分裂增殖旺盛,形态正常,生长状态良好;实验组出现增殖抑制,通过IC50评价系统检测,最优浓度为6.118g/L,为方便计算,后续实验实验组采用6g/L浓度干预细胞(图1)。

图1黄芪扶正汤处理后人TPC-1细胞的存活率

2.2黄芪扶正汤对人TPC-1细胞周期的影响

实验结果显示,黄芪扶正汤6g/L作用TPC-1细胞后,G0/G1期细胞比例增加,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.001);S期、G2/M期细胞比例降低,与对照组相比,S期细胞比例差异有统计学意义(P<0.05),说明实验组黄芪扶正汤6g/L处理TPC-1细胞后可引起细胞发生G0/G1期阻滞。见图2、图3。

图2对照组和实验组处理人TPC-1细胞后的周期流式图

图3对照组和实验组处理人TPC-1细胞后的周期分布统计图

2.3黄芪扶正汤对人TPC-1细胞凋亡的影响

流式凋亡检测结果显示,实验组(6g/L)和对照组(0g/L)细胞的凋亡率分别为22.55%、5.96%,与对照组比较,实验组细胞凋亡率明显升高,差异有统计学意义(P<0.001),说明黄芪扶正汤6g/L可诱导TPC-1细胞发生凋亡。见图4、图5。

图4对照组和实验组处理人TPC-1细胞后的细胞凋亡流式图

图5对照组和实验组处理人TPC-1细胞后的细胞凋亡统计图

2.4黄芪扶正汤对人TPC-1细胞Rb及CDK4mRNA结果分析表达的影响

qPCR实验结果显示,对照组(0g/L)和实验组(6g/L)细胞CDK4mRNA相对表达量分别为1.00000±0.08032,0.13243±0.01942;RbmRNA相对表达量分别为1.00000±0.05635,0.14843±0.01929。与对照组比较,实验组CDK4mRNA相对表达量与RbmRNA相对表达量均明显降低,差异有统计学意义(P<0.001);说明黄芪扶正汤6g/L干预细胞后,可下调细胞CDK4及RbmRNA表达。见图6。

图6对照组和实验组CDK4及RbmRNA相对表达量

3、讨论

细胞周期和细胞增殖/分裂是由细胞周期蛋白及其催化的CDKs紧密调控,CyclinD1与细胞周期蛋白CDK4/6形成Cyclin-CDK复合物,在细胞周期蛋白依赖性激酶活化激酶(CAK)的协同作用下,使其下游的Rb磷酸化,从而解除对其转录调节因子E2F-1的抑制效应,启动DNA复制,促进细胞增殖[5]。CyclinD1-CDK4/CDK6-pRb-E2F-1途径是细胞内调节增殖及细胞周期的一条重要信号通路,该途径任何成分的改变都足以破坏其正常的调节功能[6]。细胞周期蛋白失调常见于癌症、神经退行性疾病和心脏病等多种病理状态[7],由于这些原因,我们可以用CDK4-Rb-E2F-1通路来作为黄芪扶正汤治疗甲状腺乳头状癌的靶点。临床研究[8,9]发现,甲状腺肿瘤患者通常伴有免疫功能低下,免疫功能越低,患者预后越差,也是引起患者术后复发的重要因素。因此如何提高甲状腺肿瘤患者术后的免疫功能并且改善其生活质量成为临床研究面对的重点问题。近年来,中医药逐渐成为抗肿瘤综合治疗方案中的重要组成部分。中医理论认为,甲状腺癌属中医学“瘿瘤”“石瘿”范畴;情志内伤、饮食失宜是导致甲状腺癌的两大主要病因,气滞、痰凝、血瘀壅结颈前是瘿病的基本病机;本病初期多为气机郁滞,津凝痰聚,痰气搏结颈前,日久则可引起血脉瘀阻,进而气、痰、瘀三者合而为患。但是手术治疗耗气伤血,甲状腺癌患者手术治疗后,气、血、津液耗伤,可造成全身虚弱的状态[10]。中医治疗的原则为益气养阴,扶正固本,解毒散结,滋养肝肾[11]。黄芪扶正汤作为我国中医传统经验方剂,主要由黄芪、黄精、灵芝、女贞子以及枸杞等组成,黄芪归肝、脾、肾经,能健脾益气,固表排毒,敛疮生肌;黄精能益气滋阴,润肺,补肝益肾,抗衰老;灵芝能滋肝补肾,健脾益气,养心安神,化瘀祛痰,女贞子能滋阴补肾,清肝明目,扶正固本;枸杞能补肝益肾,扶正固本,滋阴补血,生津止渴[12]。

黄芪扶正汤对甲状腺癌术后免疫功能的改善见相关报道,对细胞分子生物学方面研究报道较少。本研究中,IC50评价检测出黄芪扶正汤最优有效浓度为6.118g/L,同时结果显示,其可抑制甲状腺乳头状癌TPC-1细胞增殖,诱导细胞G0/G1期阻滞,促进细胞凋亡,降低Rb及CDK4mRNA表达水平,提示黄芪扶正汤抑制人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞增殖,诱导其凋亡的作用可能与调控Rb-CDK4通路有关,这与LeeHJ[13]等研究结果一致,其分析CDK4/6双选择性抑制剂Ribociclib(LEE011)是通过抑制CDK4/6,同时抑制Rb的磷酸化及引起Rb的降解使总Rb降低,诱导ATC细胞周期阻滞于G0-G1期,促进细胞凋亡,并抑制ATC细胞增殖。研究[14]显示,黄芪有效成分芒柄花素与黄芪甲苷Ⅳ通过调控蛋白激酶B(AKT)信号转导途径诱导人食道癌HCE-4细胞凋亡。现代药理学研究显示灵芝和女贞子对肿瘤细胞亦有抑制作用,林晓萌等[15]研究发现,灵芝有效成分灵芝酸A可通过诱导细胞凋亡抑制人炎性乳腺癌SUM149细胞增殖。魏祥燕等[16]研究发现,女贞子多糖有较强的抗肿瘤作用,可增强小鼠的免疫细胞的活性和增殖能力,对卵巢癌治疗有一定价值。黄梓培等[17]研究发现枸杞多糖能缓解正己烷引起的大鼠卵巢组织的氧化应激,拮抗Nrf2及下游Ⅱ相解毒酶的活化。秦臻等[18]研究发现黄精具有补肾精、强骨髓、调五脏、抗衰老的功效,黄精可通过抑制DNA损伤检测点ATM/ATR通路的活化来调节EPCs的细胞周期,干预EPCs的老化进程。以上说明黄芪扶正汤对细胞生长影响的机制是多靶点多途径的复杂过程,本研究显示黄芪扶正汤通过降低人甲状腺乳头状癌细胞TPC-1的Rb及CDK4mRNA表达水平,促进细胞凋亡只是其作用机制的一个方面,其他方面的机制有待进一步研究。同时LauraL等[19]通过CDK4/6抑制剂治疗乳腺癌和脂肪肉瘤的疗效研究指出,CyclinD/CDK4/6抑制剂的CDK4(Ink4)/Rb信号通路在细胞周期进程中起着关键作用,选择性CDK4/6抑制剂对多种肿瘤具有较高的治疗潜力。

综上所述,黄芪扶正汤可有效下调Rb及CDK4mRNA的表达水平,引起甲状腺乳头状癌TPC-1细胞发生G0/G1期阻滞,抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡。由于本实验经费有限,只选择6g/L作为实验组研究,尚未深入研究黄芪扶正汤对甲状腺乳头状癌细胞TPC-1的增殖抑制作用是否有剂量和时间依赖性,且未行WB检测Rb及CDK4蛋白水平,这都有待下一步的深入研究。同时由于细胞周期的调控是极其精细、复杂的过程,本研究仅是体外实验,还需要进一步的动物实验和临床研究验证。

参考文献：

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