宫颈癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率仅次于乳腺癌,位居全球第二。超过85%的患者位于发展中国家,是严重危害女性身体健康的一种恶性肿瘤,其致死的主要原因是肿瘤的治疗失败、复发及转移[1]。发生转移的第一步是局限性的侵袭,这需要原发肿瘤发生许多表型的改变,其中恶性肿瘤细胞的上皮间质转化是引起肿瘤发生远处转移的关键步骤之一[2,3]。正常上皮组织的多层细胞结构不利于恶性肿瘤细胞的运动和侵袭,为了获得运动和侵袭能力,肿瘤细胞必须丢失许多上皮细胞的表型,使上皮层能够发生EMT。发生EMT的细胞,一方面失去了上皮细胞的典型形态,上皮细胞之间的相互作用消失,组织结构也相对松散,立方上皮细胞转变为纺锤形纤维细胞的形态,并且表现出侵袭性;另一方面,细胞的基因表达谱也发生改变,上皮细胞的标志性蛋白如上皮性标志物E-cadherin下调,并获得间质性标志物Vimentin、E-cadherin转录抑制因子Snail、Slug、Twist等表达[4,5]。EMT是肿瘤细胞获得转移、干细胞和化疗耐药特性的重要机制,此过程的诸多环节均受肿瘤微环境的影响。目前越来越多的证据表明EMT与化疗耐药密切相关。IderzorigT等人研究发现酪氨酸激酶抑制剂耐药的非小细胞肺癌细胞具有EMT特征,在分子标志上表现为Vimentin和N-cadherin表达增加,E-cadherin表达降低[6];所以探索研究宫颈癌细胞的EMT及宫颈癌化疗耐药的潜在分子机制并寻找相应的解决措施具有重要的理论价值与临床意义。

microRNA(miRNA)是一类非编码小RNA,通过碱基配对结合靶基因信使RNA(mRNA)的非编码区或编码区,导致mRNA的降解和(或)翻译抑制,最终造成靶基因蛋白水平降低,从而在转录后水平抑制靶基因的表达[7,8]。目前,众多研究证据表明,miRNA与肿瘤的发生发展密切相关,能够影响细胞的增殖、侵袭和迁移以及EMT[9,10]。目前所发现的与肿瘤相关的miRNA,一部分能够促进肿瘤的发生发展,具有促进恶性肿瘤的作用,而另一些则能够抑制肿瘤的发生发展,发挥抑制恶性肿瘤的作用。随着研究的逐步深入,将会有更多的与肿瘤相关的miRNA被发现。miRNA在肿瘤中的表达常常是失调的,其表达特征不仅具有组织特异性,而且在肿瘤发生的不同阶段也各有差异,分析肿瘤的组织特异的miRNA表达谱可应用于肿瘤的早期诊断并且能够指导治疗[11,12]。因此,miRNA的研究对于宫颈癌的诊断、治疗以及预后估计也具有重要意义。

本研究旨在分析miR-532通过抑制靶基因Sema4C的表达水平在宫颈癌中扮演抑癌基因的角色,逆转了宫颈癌细胞Caski的上皮间质转化及增加对顺铂化疗的敏感性,为诊断及治疗宫颈癌提供新的研究方向。

1、材料与方法

1.1细胞样本

人宫颈癌细胞株Caski细胞购自上海中乔新舟生物科技有限公司。Caski细胞用含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素与100μg/ml链霉素的DMEM培养基培养,置于37℃恒温,5%CO2饱和湿度条件下的培养箱中。

1.2细胞培养

Caski细胞用含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素与100μg/ml链霉素的DMEM培养基培养,每日于显微镜下观察细胞状态、生长情况。待细胞处于对数生长期约75%～85%密度,进行细胞传代。从培养箱取出细胞后,于生物安全柜中弃细胞培养液,加入少许细胞用PBS溶液将残余培养基洗净,弃去PBS溶液后再加入适量胰蛋白酶,于培养箱中放置约1分钟,显微镜下观察细胞形态,待细胞变圆,轻拍即悬浮时,加入完全DMEM培养基终止消化,留1/4～1/3细胞悬液补足培养基置于培养箱中培养。

1.3细胞转染

待细胞处于75%～85%密度时,按上述方法消化细胞,将细胞悬液按(2～4)×105个细胞量接种至6孔板中,待细胞生长至50%～70%密度时转染,按LipofectamineTM3000说明书将Sema4CsiRNA、miR-532mimic转染入细胞(Sema4CsiRNA,miR-532mimic购自于QIAGEN公司,该产品属于公司商业产品)。

1.4qRT-PCR

按照TRIzol法提取细胞和组织总RNA,按照反转录试剂盒说明书将提取的总RNA反转成cDNA。按照qRT-PCR试剂盒说明书进行PCR反应。qRT-PCR结果以2-△△CT值形式得到,所有样本同时对靶microRNA和内参照U6进行扩增,反应体系为20μl,每个样本重复3次。miR-532-F:5'-CAUGCCUUGAGUGUAGGACCGU-3',miR-532-R:5'-GGUCCUACACUCAAGGCAUGUU-3';Sema4C-F:5'-ACCTTGTGCCGCGTAAGACAG-3',Sema4C-R:5'-CGTCAGCGTCAGTGTCAGGAA-3';GAPDH-F:5'-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3',GAPDH-R:5'-TTAAAAGCAGCCCTGGTGAC-3';E-cadherin-F:5'-GAAGTGTCCGAGGACTTTGG-3',E-cadherin-R:5'-CAGTGTCTCTCCAAATCCGATA-3';Vimentin-F:5'-TGTCCAAATCGATGTGGATGTTTC-3',Vimentin-R:5'-TTGTACCATTCTTCTGCCTCCTG-3';Snail-F:5'-CGGAAGCCTAACTACAGCGA-3',Snail-R:5'-GGACAGAGTCCCAGATGAGC-3'。

1.5Westernblotting

提取细胞和组织总蛋白,测定其浓度及纯度后进行变性,等量上样后进行SDS-PAGE电泳。用湿转法将电泳分离的蛋白转移至PVDF膜,5%脱脂奶粉溶液室温下封闭2h。加入一抗(IGF-1R1∶6000或β-actin1∶3000)后在4℃孵育过夜,TBST洗涤3次,每次10min。加入二抗(IGF-1R1∶6000或β-actin1∶6000)室温孵育2h,TBST洗涤3次,每次15min。ECL液暗室发光显影,采集图像并分析。

1.6荧光素酶报告基因法检测

利用microRNA靶基因数据库预测miR-532与Sema4C可能的作用位点。构建Sema4C野生型3'UTR荧光素酶质粒pMIR-WT和突变型质粒pMIR-Mut。将pMIR-WT、pMIR-Mut与miR-532mimics和negativecontrolmiRNAmimics共转染进细胞,转染24小时后,去除培养基,以PBS清洗细胞三次,弃净PBS,每孔加入100μl被动裂解液(PassiveLysisBuffer,PLB),室温下将培养板置于平板摇床上,轻微晃动15分钟。待细胞裂解后,将每组20μl样本转移至发光用96孔板上,并置于超级酶标仪的检测板上,设置自动进样器1和2分别分装100μl的LARII和Stop&Glo试剂。测量时,使用1～2S延迟和5～10S读数。如此循环操作直至所有样本检测完毕。使用酶标仪配套软件进行结果分析。相对荧光素酶活性(relativeluciferaseactivity)=萤火虫荧光素酶活性(fireflyluciferaseactivity)/海肾荧光素酶活性(renillaluciferaseactivity)。

1.7Transwell细胞迁移实验

取处于对数生长期的细胞,胰蛋白酶消化,使用含10%BSA的培养基重悬细胞,调整细胞密度为1×106/ml。将滤膜孔径为8μm的Transwell小室放置于24孔板中;在小室外加入600μl含10%血清的培养基;在小室内加入100μl细胞悬液;将培养板放入孵箱,常规培养24～48h。取出小室,用PBS淋洗3次;将小室置于95%乙醇中固定5min;在0.5%结晶紫染色液中染色10min后,用PBS漂洗去除未结合细胞的染色液。用棉签轻拭去小室滤膜上层的细胞,在显微镜下观察滤膜下层细胞,每个样本随机选取10个视野拍照并计数。

1.8Transwell细胞侵袭实验

将Matrigel凝胶置于4℃过夜;次日将液化的Matrigel与培养基以1∶6的比例稀释。将滤膜孔径为8μm的Transwell小室放入24孔板中;在小室内加入50μlMatrigel稀释液,以包被滤膜;将培养板置于孵箱中4h,令包被液晾干。剩余步骤同Transwell细胞迁移实验。

1.9CCK8实验

将处于对数生长期的Caski细胞用胰蛋白酶消化,完全培养基终止,进行细胞计数,调整细胞密度为5×104/ml,将细胞接种至96孔板,每孔加入100μl细胞悬液,于培养箱中培养24小时。将配置好的顺铂(5μmol/L)加至细胞中,同时设置空白对照组(无细胞)、溶剂对照组(DMSO),每组设置3个复孔。加药后细胞培养48小时,再检测药物毒性。弃去培养基,每孔加入10μlCCK8与90μlDMEM培养基,注意防止气泡产生,用锡箔纸将96孔板包被避光,放置于培养箱中培养2小时,用酶标仪于450nm波长下检测OD值,计算药物抑制率。药物抑制率(%)=[1-(OD加药组均值-OD空白组均值)/(OD溶剂对照组均值-OD空白组均值)]×100%。

1.10统计学方法

采用SPSSStatistics22.0统计软件进行统计学分析,两个数据间以两单独样本t检验,数据以x¯±s表示,组间比较采用t检验及方差分析,P<0.05为差异具有显著性。

2、结果

2.1沉默Sema4C表达逆转宫颈癌细胞Caski上皮间质转化

为了检测宫颈癌细胞Caski经过沉默Sema4C表达后EMT标志物表达水平,首先我们利用小分子RNA干扰技术沉默Caski细胞Sema4C基因表达,Westernblot检测结果发现转染Sema4CsiRNA可显著下调Sema4C蛋白表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05)(图1A)。然后qRT-PCR检测其mRNA的表达水平,也发现同样结论,差异具有统计学意义(P<0.01)(图1B)。同时根据实验结果,我们选择沉默效应最好的Sema4Csi-2进行后续功能实验。随后我们将Sema4Csi-2转染Caski细胞后,qRT-PCR与Westernblotting结果显示上皮属性标志物E-cadherin在蛋白表达水平与mRNA表达水平均明显上调,同样检测间质性标志物Vimentin与Snail的蛋白表达水平与mRNA表达水平,发现其表达水平均显著下降,差异具有统计学意义(P<0.01)(图1C-F)。上皮间质转化常伴随细胞迁移、侵袭等能力增加,我们分别利用Transwell迁移与Transwell侵袭实验检测沉默Sema4C表达所引起的宫颈癌细胞Caski迁移与侵袭能力变化。Transwell迁移实验发现,与阴性对照siRNA(NCsi)相比,Sema4Csi-2降低Caski细胞迁移能力,差异具有统计学意义(P<0.05)(图1G)。同样Transwell侵袭实验也发现Caski细胞在经过沉默Sema4C基因表达后侵袭能力减弱,差异具有统计学意义(P<0.05)(图1H)。以上结果提示我们,Sema4C参与调节宫颈癌细胞Caski上皮间质转化,下调Sema4C可逆转这一过程。

2.2Sema4C是miR-532直接的靶基因

近年来,有越来越多研究显示miRNA参与EMT调控机制。为了从miRNA的表达水平阐明Sema4C调控宫颈癌细胞EMT的分子机制,我们通过miRNA靶基因预测软件(Targetscan)发现Sema4C基因可能接受miR-532的直接调控(图2A)。为了证实以上推测,我们将Sema4C长910bp的3'UTR克隆进pMIR-RB-REPORTTM双荧光素酶报告载体hRluc基因下游构建野生型Sema4C3'UTR载体(WT),同时将Sema4C3'UTR上预测可能与miR-532结合的位点突变构建突变型Sema4C3'UTR载体(MU)。将miR-532mimic分别与野生型或突变型Sema4C3'UTR载体共转入细胞,结果发现miR-532mimic可显著下调野生型Sema4C3'UTR载体的荧光素酶活性,而在突变型Sema4C3'UTR载体中,与对照组相比,miR-532mimic并未明显下调载体荧光素酶活性,差异具有统计学意义(P<0.01)(图2B)。然后,我们利用Westernblotting与qRT-PCR检测Caski细胞经过miR-532mimic或anti-miR-532处理后Sema4C的蛋白表达水平与mRNA表达水平,结果显示miR-532mimic可在蛋白表达水平与mRNA表达水平下调Sema4C表达,而利用anti-miR-532抑制宫颈癌细胞CaskimiR-532表达后可上调Sema4C基因的蛋白表达水平与mRNA表达水平,差异具有统计学意义(P<0.01)(图2C-D)。以上结果提示我们,Sema4C是miR-532直接的靶基因。

2.3过表达miR-532逆转宫颈癌细胞的EMT

为了证实miR-532是否参与宫颈癌细胞EMT,我们用miR-532mimic转染宫颈癌细胞Caski,观察过表达miR-532是否会影响EMT标志物的表达。首先,我们利用qRT-PCR检测发现miR-532mimic可显著提高宫颈癌细胞Caski中miR-532的表达水平,差异具有统计学意义(P<0.01)(图3A)。然后通过Westernblotting实验证实过表达miR-532可导致上皮属性标志物E-cadherin的蛋白表达水平显著升高,而导致间质属性标志物Vimentin与Snail的蛋白表达水平下调,差异具有统计学意义(P<0.05)(图3B)。qRT-PCR检测也发现过表达miR-532可导致EMT标志物E-cadherin、Vimentin、SnailmRNA的表达水平呈现与蛋白表达水平相同的趋势变化,差异具有统计学意义(P<0.01)(图3C-F)。为了证实过表达miR-532是否会影响宫颈癌细胞Caski迁移与侵袭能力,我们分别利用Transwell迁移与Transwell侵袭实验检测Caski细胞经过转染miR-532mimic后迁移、侵袭能力的变化。结果发现与阴性对照相比,过表达miR-532可抑制宫颈癌细胞Caski迁移与侵袭能力,差异具有统计学意义(P<0.05)(图3G-H)。以上结果提示我们,miR-532可逆转宫颈癌细胞的EMT。

图1沉默Sema4C表达对宫颈癌细胞Caski上皮间质转化的影响(结晶紫染色×40)

2.4过表达miR-532及沉默Sema4C提高宫颈癌细胞顺铂化疗敏感性

肿瘤细胞获得EMT特征后不但会增强其迁移、侵袭能力,也会产生耐药特性。所以,我们为研究过表达miR-532及沉默Sema4C是否会影响宫颈癌细胞对顺铂化疗敏感性,我们利用CCK8实验进行宫颈癌细胞经过miR-532mimic及Sema4CsiRNA处理后对顺铂耐药性检测。结果发现,与单用顺铂组相比,宫颈癌细胞Caski在经过miR-532mimic及Sema4Csi-2预处理24小时后,5μmol/L顺铂诱导的细胞生长抑制效应显著增强。单用顺铂组药物抑制率约为23%,顺铂联用Sema4Csi-2组药物抑制率约为46%,顺铂联用miR-532mimic组药物抑制率约为52%,实验重复三次进行统计学分析,差异具有统计学意义(P<0.05)(图4)。以上结果提示我们,过表达miR-532及沉默Sema4C能显著提高宫颈癌细胞对顺铂敏感性。

3、讨论

上皮间质转化是指上皮细胞通过特定的程序转化为具有间质特性细胞的复杂生物学过程,其主要的特征表现为上皮性标志物E-cadherin下调,并获得间质性标志物Vimentin、E-cadherin转录抑制因子Snail、Slug、Twist等表达。EMT是肿瘤细胞获得转移、干细胞和化疗耐药特性的重要机制,此过程的诸多环节均受肿瘤微环境的影响[13]。Sema4C是跨膜型信号素蛋白,是SemaphorinⅣ基因家族表达产物之一[14]。有研究表明Sema4C在EMT中也发挥重要的调节作用[15]。但关于Sema4C在宫颈癌细胞中是否参与调节EMT与化疗耐药的研究目前尚不明确,所以本研究深入探讨Sema4C的作用及其机制。本研究中,我们发现沉默Sema4C可使Caski细胞E-cadherin表达升高,Vimentin、Snail表达下降从而逆转宫颈癌细胞EMT。分别利用Transwell迁移与Transwell侵袭实验检测沉默Sema4C表达所引起的宫颈癌细胞Caski迁移与侵袭能力变化,发现Caski细胞在经过沉默Sema4C基因表达后迁移、侵袭能力均减弱。结果提示我们,Sema4C参与调节宫颈癌细胞Caski上皮间质转化,沉默Sema4C可逆转这一过程。

microRNA(miRNA)是一类长约18～25个核苷酸、机体内源性表达的非编码小分子RNA,具有时空特异性,并参与基因转录后水平的调控,可同时调控多个蛋白质编码基因以及多条与肿瘤生长、凋亡、转移相关的分子通路。近年来,有越来越多研究显示miRNA参与EMT调控机制[16]。本研究为了从miRNA的表达水平阐明Sema4C调控宫颈癌细胞EMT的分子机制,我们通过miRNA靶基因预测软件(Targetscan)发现Sema4C基因可能接受miR-532的直接调控,并用双荧光素酶实验、Westernblotting及qRT-PCR验证了Sema4C是miR-532直接的靶基因。

图2Sema4C是miR-532直接的靶基因

图3过表达miR-532逆转宫颈癌细胞的EMT(结晶紫染色×40)

图4CCK8实验检测细胞生长情况(*P<0.05)

近年来miRNA与化疗诱导的EMT之间的联系也被广泛研究。有研究报道,在顺铂耐药肺癌细胞中抑制miR-103表达可诱导细胞凋亡、降低细胞迁移侵袭能力并逆转间质表型,并在体内外实验均证实下调miR-103增加顺铂治疗敏感性。还有报道,miR-200c在乳腺癌细胞中通过靶标ZNF217与ZEB1抑制EMT从而增加肿瘤细胞对曲妥单抗治疗敏感性[17]。本研究中,为了证实miR-532是否参与宫颈癌细胞EMT,我们用miR-532mimic转染宫颈癌细胞Caski,观察过表达miR-532是否会影响EMT标志物的表达。结果发现miR-532通过上调E-cadherin表达,下调Snail、Vimentin表达可逆转宫颈癌细胞Caski上皮间质转化。因此,miR-532同样支持miRNA调节化疗相关EMT这一观点,可逆转宫颈癌细胞的EMT。同时,过表达miR-532可抑制宫颈癌细胞Caski迁移与侵袭能力。

miRNA是进化保守的内源性小分子非编码RNA,通过转录后水平调节靶基因的表达在众多生理及病理过程中发挥重要作用,如炎症、细胞周期、细胞分化、凋亡与侵袭等。有文献报道miRNA通过调节化疗耐药或化疗敏感相关的基因参与肿瘤细胞对化疗药物敏感性过程[18]。为深入了解这一现象,我们需要更多的研究从miRNA角度去探索研究参与化疗耐药的特定miRNA及其机制。顺铂及铂类衍生物是宫颈癌化学治疗的重要药物[19]。但在晚期或复发宫颈癌病人中往往由于内在或外在因素对顺铂治疗产生耐药,从而导致化疗失败。因此,阐明宫颈癌顺铂化疗耐药的发生机制,为改善病人化疗结局提供新颖的治疗策略是十分必要的。本研究中我们为研究过表达miR-532及沉默Sema4C是否会影响宫颈癌细胞对顺铂化疗敏感性,我们利用CCK8实验进行宫颈癌细胞经过miR-532mimic及Sema4CsiRNA处理后对顺铂耐药性检测,结果发现,过表达miR-532及沉默Sema4C能显著提高宫颈癌细胞对顺铂敏感性。

综上所述,本研究揭示了miR-532通过抑制靶基因Sema4C的表达水平在宫颈癌中扮演抑癌基因的角色,逆转了宫颈癌细胞Caski的上皮间质转化及增加对顺铂化疗的敏感性。因此miR-532具有成为宫颈癌诊断及治疗新靶点的潜力。

朱慧,康天天,常卓,吴怡,冯晓玲.miR-532抑制Sema4C逆转宫颈癌细胞上皮间质转化及增加对顺铂化疗的敏感性[J].现代肿瘤医学,2020,28(19):3299-3305.