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miR-199b-5p在2型乳头状肾细胞癌合并下的表达

2021-04-16 160 上传者：管理员

摘要：目的：探讨miR-199b-5p在2型乳头状肾细胞癌（PRCC）合并下腔静脉瘤栓患者中的表达及其功能。方法：应用miRNA芯片检测2型PRCC合并及不合并下腔静脉瘤栓各10例患者的miRNA差异表达谱。应用RT-qPCR在22对样本中对差异表达的候选基因进行扩大样本验证。使用miR-199b-5p的过表达质粒（miR-199b-5p-up）和阴性对照质粒（NC）分别转染CAKI-2和CAL-54细胞，检测2组细胞的增殖及侵袭能力变化情况，细胞增殖抗原（Ki67）和基质金属蛋白酶2(MMP2)的表达。结果：与不合并下腔静脉瘤栓的2型PRCC组织样本相比，合并瘤栓的癌组织中miR-199b-5p显著下调（P<0.05）。与NC组相比，miR-199b-5p-up组CAKI-2和CAL-54细胞的增殖和侵袭能力均降低（P<0.05）。对照组和合并下腔静脉瘤栓组的癌组织样本中，Ki67和MMP2表达分别显著高于miR-199b-5p-up组和不合并下腔静脉瘤栓组（均P<0.05）。结论：肾癌中miR-199b-5p下调可能通过调控Ki67和MMP2介导2型PRCC下腔静脉瘤栓的形成。

关键词：
2型乳头状肾细胞癌
miR
肿瘤细胞
静脉瘤栓
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肾癌是泌尿外科常见的恶性肿瘤之一，占成年人所有恶性肿瘤的2%～3%[1]。根据肿瘤组织细胞的形态学特点，结合基因改变和肿瘤的起源可将肾细胞癌分为多种亚型。其中，乳头状肾细胞癌（papillaryrenalcellcarcinoma,PRCC）是仅次于透明细胞癌的第二大肾细胞癌亚型，占全部肾细胞癌15%～20%[2]。根据细胞及结构特征，将PRCC分为1型和2型。一般认为2型的恶性程度显著高于1型。进展期肾癌的生物学特点之一为静脉系统受到累及，其发生率约4%～10%[3]。静脉系统受累的2型PRCC患者预后更差，其5年肿瘤特异性生存率仅为57.4%[4]。但关于肾癌静脉瘤栓形成的机制目前尚未清楚，研究显示，瘤栓的形成与BRCA的基因突变[5]、PD-L1表达缺失[6]等有关。miRNA是一类长约20个核苷酸的RNA，主要在转录水平上调节基因表达，广泛参与正常及异常的生物学过程，并在肾癌的发生发展中发挥重要的作用[7]。现阶段对于miRNA在2型PRCC下腔静脉瘤栓形成中的作用尚不明确，本研究着重探讨miR-199b-5p在2型PRCC合并下腔静脉瘤栓中的表达及功能。

1、材料和方法

1.1临床样本及资料

纳入2012年1月～2018年3月在北京大学第三医院及中日友好医院泌尿外科住院治疗的2型PRCC合并及不合并下腔静脉瘤栓患者组织样本各22份，44例患者均经术前CT和术后病理证实，诊断标准符合2014版欧洲泌尿外科肾癌诊治指南标准。其中男38例、女6例；年龄45～84岁，中位年龄66岁。所有研究对象均签署知情同意书，本研究获得北京大学第三医院及中日友好医院伦理委员会批准。

1.2miRNA芯片、细胞和主要试剂

miRNA芯片为AgilentHumanmiRNA,Release21.0(8×60K,DesignID:070156）。人肾癌细胞系CAKI-2和CAL-54细胞分别从美国典型培养物保藏中心（ATCC）和德国DSMZ获得。CAKI-2培育在含10%胚牛血清（FBS）的McCoy's5A培养基，CAL-54在含有15%FBS、0.4μg/ml氢化可的松和10ng/mlEGF的DMEM细胞培养基中生长。细胞培养基和胚牛血清购自Gibco公司；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；RT-qPCR引物由北京天一辉远生物公司合成；CCK8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。miR-199b-5p过表达质粒（miR-199b-5p-up）及阴性对照质粒（NC）均为上海吉凯生物公司产品。瞬转试剂使用Lipofectamine2000(ThermoFisher,11668030）。逆转录及RT-qPCR试剂盒为北京全金式生物公司产品。

1.3主要实验方法

细胞系选择：基于PRCC癌细胞性状的文献证据及基因表达特性，选择了CAKI-2和CAL-54细胞作为2型PRCC最适合的细胞系[8]。细胞培养技术遵循常规细胞培养技术方法，瞬转操作按照Lipo2000说明书操作。

CCK-8检测细胞增殖能力：取对数生长期的CAKI-2、CAL-54分别转染miR-199b-5p-up和NC后，接种于96孔板，每孔接种1×103个细胞，每组设置6个复孔。于转染后24h、48h、72h、96h、120h，分别在每组各孔加入10μlCCK-8溶液，37℃孵育3h后于酶标仪450nm处测量吸光度。

细胞侵袭实验：使用Matrigel基质胶与PBS缓冲液按1:8比例配置Transwell小室基质膜。消化、离心、计数细胞后，按照2×104/ml用无血清培养基稀释细胞制备成CAKI-2、CAL-54细胞悬液。按照每孔200μl，将细胞悬液加入Transwell上室，下室加入完全培养基500μl,37℃孵箱培养24h后，使用75%乙醇及1%结晶紫溶液固定和染色，晾干后拍照计数。

RNA提取、逆转录、qPCR：使用TRIzol试剂提取组织和细胞中的总RNA，按照试剂盒说明书逆转录为cDNA,qPCR采用SYBRGreenI荧光染料法完成。miR-199b-5p正向引物为5’-CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC-3’，反向引物为通用引物；细胞增殖抗原（Ki67）正向引物为5’-AGAAGAAGTGGTGCTTCGGAA-3’，反向引物为5’-CAGACCCATTTACTTGTGTTGGA-3’；基质金属蛋白酶2(MMP2）正向引物为5’-CCCACT-GCGGTTTTCTCGAAT-3’，反向引物为5’-CAAAGGGGTATCCATCGCCAT-3’。采用GAPDH作为内参，正向引物为5’-GAAGGTGAAGGTCG-GAGTCAAC-3’，反向引物为5’-CAGAGT-TAAAAGCAGCCCTGGT-3’。通过2-△△Ct计算RNA相对表达量。所有实验均独立重复3次。

1.4统计学方法

应用SPSS22.0软件进行统计学分析。2组数据之间的比较采用独立样本t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析。

2、结果

2.1miR-199b-5p在肾癌合并下腔静脉瘤栓癌组织中表达下调

miRNA芯片检测发现，在2型PRCC合并下腔静脉瘤栓癌10例患者的组织中相对于配对的不合并下腔静脉瘤栓的癌组织中，包括miR-199b-5p、miR-218-5p、miR-96-5p等63条在内的miRNA下调；包括miR-7155-3p、miR-4685-5p等的154条miRNA上调（图1A，见封二）。使用RT-qPCR在22对样本中对差异表达的候选基因进行扩大样本验证，发现miR-199b-5p在肾癌合并下腔静脉瘤栓中表达显著下调（P<0.05）（图1B，见封二）。

2.2过表达miR-199b-5p抑制肾癌细胞增殖、克隆形成、侵袭能力

为了验证miR-199b-5p生物学功能，使用CCK-8法检测过表达miR-199b-5p对于CAKI-2和CAL-54细胞增殖影响。与NC组相比，miR-199b-5p-up组的CAKI-2和CAL-54细胞增殖活力降低，并呈时间依赖性（图2A和2B，见封二）。细胞侵袭实验结果表明，与NC组相比，miR-199b-5p-up组的CAKI-2和CAL-54细胞的侵袭能力降低（P<0.05）（图2C和2D，见封二）。

2.32型PRCC合并下腔静脉瘤栓组织样本中Ki67和MMP2表达显著升高

图3示，与不合并下腔静脉瘤栓组织相比，合并下腔静脉瘤栓组织中Ki67和MMP2表达显著升高（P<0.05）（图3）。

2.4过表达miR-199b-5p后Ki67和MMP2表达下调

图4示，过表达miR-199b-5p后，Ki67和MMP2在CAKI-2细胞中表达显著下调（P<0.05），而在CAL-54细胞中无差异。

图3肾癌合并下腔静脉瘤栓组织中Ki67和MMP2表达

图4过表达miR-199b-5p后瘤栓和MMP2表达下调

3、讨论

肾癌是泌尿外科常见的恶性肿瘤之一，25%～30%的患者在诊断时已经发生转移性疾病[9]。肾癌Ⅰ期患者的5年生存率为95%[10]，而2型PRCC的患者预后更差。对于合并下腔静脉瘤栓的患者，5年总体生存率及肿瘤特异性生存率分别为41.9%及47.7%[11]。因此，明确肾癌合并瘤栓的发病机制，对于早期发现和治疗肾癌具有重要意义。

3.1miR-199b-5p在2型PRCC合并瘤栓患者中的表达情况

本研究发现，与不合并下腔静脉瘤栓的2型PRCC患者相比，合并瘤栓的患者癌组织中miR-199b-5p显著下调。通过体外细胞系中将miR-199b-5p过表达，肾癌细胞的增殖和侵袭能力显著降低。结果提示，miR-199b-5p与PRCC瘤栓的形成密切相关。相关文献报道，miR-199b-5p参与到多种肿瘤的生物学行为：Won等[12]提出miR-199b-5p通过介导的Notch信号通路促进骨肉瘤的发生发展；Fang等[13]的研究表明miR-199b-5p的下调与乳腺癌侵袭性临床特征相关，且miR-199b-5p下调是与乳腺癌患者更差的总体生存率相关，是其独立的不良预后因素；Wang等[14]报道，miR-199b低表达可能通过介导缺氧诱导因子-1α上调促进肝细胞癌进展并与生存率呈负相关。在泌尿系统肿瘤中，Lai等[15]报道miR-199b-5p是肾透明细胞癌的一种抑癌因子，但其具体作用机制尚未阐明。此外，其异常表达也见于卵巢癌及髓母细胞瘤等其他恶性肿瘤[16,17]。

3.2miR-199b-5p的下调可能通过介导Ki67和MMP2表达调控下腔静脉瘤栓的形成

对于肾癌瘤栓的形成机制，目前研究尚不充分。Gregor等[18]通过对37例原发性肿瘤和瘤栓组织进行全外显子组测序，发现瘤栓组织中的约22%的基因存在功能性突变，认为某些亚类基因的突变可能导致肾癌瘤栓形成。Justin等[19]多组学生物信息学分析发现，肝细胞核因子1β与肾透明细胞癌的肿瘤相关瘤栓形成有关，但未探究其具体机制。有研究报道肾癌瘤栓的发生与BRCA的基因突变及PD-L1表达缺失等有关[5,6]。本研究中，我们检测了2型PRCC合并及不合并瘤栓组织中代表细胞增殖能力和侵袭能力的Ki67和MMP2，发现合并下腔静脉瘤栓组织中Ki67和MMP2表达显著升高，而在肾癌细胞系中，过表达miR-199b-5p后，细胞中瘤栓和MMP2表达下调，提示2型PRCC中miR-199b-5p下调可能通过介导Ki67和MMP2表达调控下腔静脉瘤栓的形成。

本研究存在一些局限性。虽然研究证实表达miR-199b-5p可以抑制2型PRCC细胞系增殖和侵袭能力，但具体的分子机制未予更深层次的探究，且体外培养细胞系尚不能代表肾癌的全部病理特征，同时亦缺少挽救实验进行反向验证。

参考文献：

[3]北京市瘤栓协作小组.肾癌伴静脉瘤栓北京专家共识[J].微创泌尿外科杂志,2017,6(6):321-327.

[11]柯鑫文,胡志全,曾星,等.肾癌伴下腔静脉瘤栓患者术后长期随访报告[J].临床外科杂志,2017,25(2):120-123.

丁振山,周晓峰,马潞林.miR-199b-5p在2型乳头状肾细胞癌合并下腔静脉瘤栓中的表达及功能[J].中日友好医院学报,2021,35(02):81-84+64.