首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 肿瘤科论文 > 肿瘤细胞论文 > DDIT3调控TNF-α刺激下ATDC5细胞软骨向分化

DDIT3调控TNF-α刺激下ATDC5细胞软骨向分化

2021-05-19 190 上传者：管理员

摘要：目的:探究在肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)刺激下，DNA损伤诱导转录因子3(DNAdamageinducibletranscript3,DDIT3)对ATDC5细胞软骨向分化的调控。方法:不同浓度TNF-α(0、1、10、20ng/mL)刺激下诱导ATDC5细胞分化7d,同时在10ng/mLTNF-α刺激下诱导慢病毒稳定转染ATDC5细胞分化7d,qRT-PCR检测炎症相关因子环氧化酶(cyclooxygenase,COX)2、白细胞介素(interleukin,IL)-6、一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,NOS)2、基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)-13的表达，Westernblot检测DDIT3、软骨向分化指标Sox9、Col10a1以及p-AKT、AKT蛋白表达情况，阿尔新蓝染色检测细胞外基质形成情况。结果:不同浓度TNF-α刺激下诱导ATDC5细胞分化引起COX2、IL-6、NOS2、MMP-13和DDIT3表达明显升高，Sox9、X型胶原蛋白(collagentypeXalpha1chain,Col10a1)的表达下降。敲低DDIT3部分逆转了10ng/mLTNF-α刺激导致的Sox9、Col10a1的表达下降和细胞外基质形成减少，同时促进磷酸化蛋白激酶B(phosphorylatedproteinkinaseB,AKT)蛋白表达。结论:在TNF-α诱导的炎症微环境中，DDIT3调控了ATDC5细胞软骨向分化。

关键词：
ATDC5细胞
DNA损伤诱导转录因子3
肿瘤坏死因子
软骨向分化
加入收藏

颞下颌关节骨关节炎(temporomandibularjointosteoarthritis,TMJOA)是临床上常见的一种退行性关节病变，其主要病理特征为进行性关节软骨退变、滑膜炎和软骨下骨硬化等[1]。如何促进并维持软骨细胞的表型仍然是骨关节炎(osteoarthritis,OA)治疗中的挑战，因此，研究炎症状态下软骨细胞分化的调节机制有助于为TMJOA的治疗提供理论指导。

软骨细胞在受到炎症因子刺激下会产生细胞应激反应。DDIT3作为一种内质网应激通路中的关键转录因子，可以调控细胞凋亡和炎症过程[2]。虽然DDIT3被证明在小鼠成软骨发育过程中表达水平升高[3],前期实验也证明了在正常状态下敲低DDIT3可以促进成软骨细胞分化[4],然而在炎症状态如TNF-α刺激下，DDIT3是否以及如何调控细胞软骨向分化仍有待进一步研究。本研究以ATDC5细胞为研究对象，构建TNF-α刺激下的体外炎症模型，探讨DDIT3对ATDC5细胞软骨向分化的调控作用。

1、材料与方法

1.1主要试剂与仪器

DMEM/F12培养基(Hyclone,美国);胎牛血清(四季青，杭州);胰岛素铁硒传递蛋白(insulin-transfering-selenium,ITS,Sigma,美国);TNF-α(安诺伦，北京);一抗β-actin(三鹰，武汉);DDIT3(Santacruz,美国);Sox9(Abcam,美国);Col10a1(Abclonal,武汉);p-AKT和AKT(CST,美国);BCA蛋白浓度检测试剂盒(碧云天，上海);COX2、IL-6、NOS2、MMP13的引物(生工生物，上海);SYBRGreenPCR试剂盒(诺唯赞，南京);细胞培养箱(Thermo,美国)。

1.2ATDC5细胞的培养与诱导

ATDC5细胞购于中国科学院上海细胞库，将其置于含10%胎牛血清、1%双抗的生长培养基(DMEM/F12)中，于37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞每2d换液1次。待细胞密度至70%～80%,弃生长培养基，更换为含不同浓度TNF-α(0、1、10、20ng/mL)的成软骨向诱导培养基(生长培养基+1×ITS+维生素C)诱导培养7d。

1.3构建DDIT3对照和敲低的慢病毒稳定转染细胞

用pLKO.1-DDIT3-con(对照组，con)和pLKO.1-DDIT3-sh(敲低组，sh)质粒(淼灵生物，武汉)以及包装质粒在293e细胞中进行转染并收集48h的病毒液感染野生型ATDC5细胞。

1.4细胞分组

con组中加不含TNF-α的诱导培养基，con组和sh组中分别加含10ng/mLTNF-α的诱导培养基。

1.5qRT-PCR

去除培养基后提取细胞mRNA,使用SYBRGreenPCR试剂盒将其逆转录为cDNA引物序列，见表1。并按照其方法说明上样后通过PCR仪检测荧光信号并用2-ΔΔCt方法计算细胞内COX2、IL-6、NOS2、MMP-13的基因相对表达量。

表1qRT-PCR引物序列

1.6Westernblot

去除培养基后加入RIPA裂解液，在冰上提取细胞内总蛋白并使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性后置10%聚丙烯酰胺凝胶上样电泳，转膜，于5%脱脂奶粉封闭1h后分别添加DDIT3、Sox9、Col10a1、p-AKT、AKT一抗4℃孵育过夜。洗膜3遍后孵育二抗1h,用电化学发光液孵育3min后在凝胶成像系统中显影得到蛋白条带，用ImageJ软件进行灰度值分析计算蛋白相对表达量。

1.7阿尔新蓝染色

弃培养基用磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersolution,PBS)冲洗后4%多聚甲醛固定10～15min,PBS漂洗3次后加入阿尔新蓝染液(Sigma,美国),4℃染色过夜。PBS冲洗后拍照。

1.8统计学分析

所有实验均重复至少3次。所有数据使用GraphpadPrismVersion5.0分析，结果用x¯±s表示。两组间比较采用独立样本t检验。多组间比较采用单因素方差分析(analysisofvariation,ANOVA),当差异具有统计学意义时两组间比较采用Tukey检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1TNF-α刺激对炎症相关因子和DDIT3表达以及ATDC5细胞软骨向分化的影响

与0ng/mL组相比，不同浓度(1、10、20ng/mL)TNF-α刺激下诱导野生型ATDC5细胞分化7d均引起COX2、IL-6、NOS2、MMP-13基因表达升高(图1),DDIT3蛋白表达水平明显升高，而10ng/mL和20ng/mL组软骨向分化标志物Sox9和Col10a1蛋白表达明显下降(图2a、2b)。10ng/mL组细胞形态无明显变化，因此后续实验采用10ng/mLTNF-α刺激。

图1TNF-α刺激对ATDC5细胞中COX2、IL-6、NOS2、MMP13表达的影响

图2TNF-α刺激对ATDC5细胞中DDIT3、Sox9及Col10a1蛋白表达的影响

2.2构建DDIT3基因敲低的ATDC5细胞

与con组(0.44±0.32)相比，sh组DDIT3蛋白表达水平(0.19±0.24)明显下降(P<0.001,图3)。

2.3DDIT3对TNF-α刺激下ATDC5细胞软骨向分化的作用

con组加TNF-α(10ng/mL)刺激诱导分化7d与不加TNF-α组相比，Sox9、Col10a1蛋白表达量明显下降，sh组相比于con组明显升高(图4a、4b)。阿尔新蓝染色同样证明了DDIT3敲低明显促进TNF-α刺激下ATDC5细胞细胞外基质形成(图4c)。

图3Westernblot检测构建的慢病毒稳定转染ATDC5细胞中DDIT3蛋白的表达

图4DDIT3对TNF-α刺激下ATDC5细胞软骨向分化的影响

2.4DDIT3对AKT信号通路的作用

Con组和sh组细胞加10ng/mLTNF-α诱导分化7d后，Westernblot表明DDIT3敲低促进p-AKT蛋白表达量增多(con+TNF-α:0.38±0.13;sh+TNF-α:0.81±0.09,P<0.001),即激活了AKT信号通路(图5)。

3、讨论

TMJOA是常见的软骨相关疾病，软骨细胞是成熟软骨组织内唯一的细胞类型，其在OA发生和发展过程中起到重要作用。在OA的软骨中，促炎因子IL-1、TNF-α、IL-6等的表达明显上升，软骨细胞在受到炎症刺激后产生内质网应激，内质网应激相关转录因子DDIT3表达明显升高，起初细胞通过非折叠蛋白反应和自噬维持细胞稳态，后期软骨细胞凋亡增多，软骨退变严重且细胞外基质合成减少[5]。然而，DDIT3在炎症刺激下是否以及如何参与调控细胞的软骨向分化尚未明了。本研究结果表明，DDIT3可能负向参与调控TNF-α刺激下ATDC5细胞的软骨向分化。

图5Westernblot检测DDIT3对TNF-α刺激下ATDC5细胞中p-AKT、AKT表达的影响

TNF-α是OA进程中的关键炎性细胞因子，通过上调MMP的表达、抑制蛋白多糖和胶原的合成，引起软骨基质的降解[6]。本研究在ATDC5细胞中加入不同浓度TNF-α,同时诱导软骨向分化，结果发现炎症因子COX2、IL-6、NOS2、MMP-13表达明显升高，说明成功构建了体外炎症微环境。DDIT3在内源性或外源性刺激下引起的内质网应激过程中具有促进细胞凋亡，激活相关分子和通路的作用[7]。已发现DDIT3参与调控很多炎症相关的疾病[8,9],如对牛的膝关节软骨细胞采用IL-1β刺激后有大量DDIT3表达，并引起软骨细胞基质降解[9]。本研究发现在不同浓度TNF-α刺激下诱导ATDC5分化，DDIT3的表达明显升高，提示TNF-α刺激能够诱导ATDC5细胞产生内质网应激反应，这与之前的研究结果一致，然而DDIT3表达升高与OA发展进程之间的关系仍未明确。其中10ng/mL和20ng/mL浓度组软骨向分化标志物表达受到显著抑制，表明一定浓度的TNF-α刺激抑制了ATDC5细胞的软骨向分化。由于在20ng/mL浓度刺激下可观察到有较多漂浮的死细胞，因此后续实验采用10ng/mL浓度。为了进一步验证DDIT3在TNF-α刺激下对ATDC5细胞软骨向分化的调节作用，本实验中构建了DDIT3对照和敲低的稳定转染细胞，结果发现敲低DDIT3部分恢复了TNF-α刺激对软骨向分化的抑制作用。以上结果表明DDIT3负向调控TNF-α刺激下ATDC5细胞的软骨向分化。

最近有多项研究表明磷酸肌醇-3激酶(phosphoinositide-3kinase,PI3K)/AKT通路参与调节软骨向分化过程[10,11]。AKT的持续活化可以促进ATDC5细胞的软骨向分化，相反抑制PI3K通路会抑制软骨向分化标志物Ⅱ型胶原蛋白(collagentypeⅡalpha1chain,Col2a1)的表达以及磷酸化蛋白聚糖的生成。另外有研究发现p-AKT在骨关节炎软骨细胞中表达下调[12]。本研究在TNF-α刺激下诱导ATDC5细胞分化，发现敲低DDIT3能促进p-AKT的表达，这与之前的研究结果一致，p-AKT对炎症状态下细胞软骨向分化起到促进作用[12]。以上结果表明AKT通路可能参与DDIT3对TNF-α刺激下ATDC5细胞分化的负向调控过程。

综上所述，TNF-α刺激可诱导ATDC5细胞中DDIT3的表达，抑制了细胞软骨向分化；敲低DDIT3部分恢复TNF-α刺激对ATDC5细胞软骨向分化的抑制作用，同时激活AKT信号通路，表明DDIT3通过AKT信号通路负向调控了TNF-α刺激下ATDC5细胞的软骨向分化，有可能成为治疗TMJOA的一个潜在靶点。然而，有关DDIT3调控的具体作用机制仍有待进一步研究。此外，本研究只进行了DDIT3敲低处理，未探究DDIT3过表达是否加重TNF-α刺激对ATDC5细胞分化的抑制作用，且以上结果仍有待在动物体内进一步验证。

参考文献：

[1]胡智慧,房维.高迁移率族蛋白1在颞下颌关节骨关节炎中的研究进展[J].口腔医学研究,2020,36(12):1099-1104.

[11]梁德凤,周鑫才,吴芸菲.二甲双胍调节PI3K/AKT通路对高糖诱导牙周膜成纤维细胞凋亡的影响研究[J].口腔医学研究,2020,36(12)∶1103-1107.

文章来源：杨畅,许筱霄,董晓菲,董伟,王家伟.DDIT3调控TNF-α刺激下ATDC5细胞软骨向分化[J].口腔医学研究,2021,37(05):448-452.