程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)是机体细胞在相关信号通路的作用下自发性死亡，是维持正常细胞周期和组织内稳态的重要条件，通过该机制的作用，应激、受损、恶变或感染的细胞被裂解并有效清除[1]。不同类型的细胞死亡并非相互独立，而是共享一个协调系统，当一条途径出现异常缺陷时，其他调节机制将确保细胞死亡的过程，重要的是，PCD调节机制的故障与疾病的发生和发展有关[2]。m6A甲基化对mRNA和非编码RNA的修饰是常见的方式，通过影响RNA代谢，从而抑制调控蛋白的表达。此外，PCD通过对转录的影响和翻译后蛋白质的修饰进而引起细胞死亡[3]。随着研究的进展，越来越多的研究表明m6A可能通过调节基因表达，从而影响各种程序性细胞死亡过程。本文将详细阐述m6A甲基化在肿瘤细胞程序性死亡中的作用机制，为相关肿瘤疾病的诊疗提供参考。

1、m6A甲基化在机体内的作用

1.1 m6A的组成

m6A甲基化的组成是腺苷第6位氮原子(N)受到一种特异性甲基化修饰，是真核细胞内常见的mRNA修饰[4]。m6A甲基化由甲基化转移酶(writers)、去甲基化酶(erasers)和识别蛋白(readers)组成，分别负责m6A的添加、去除和识别[5]。Writers即m6A甲基转移酶，负责催化，其组成主要包括METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429[6],其中METTL3与METTL14形成稳定的异二聚体复合物参与RNA甲基化修饰，WTAP其主要作用招募METTL3与METTL14形成甲基化酶复合物[7,8]。KIAA1429也在甲基化酶复合物中起重要作用，研究发现KIAA1429基因的敲除导致m6A甲基化酶活性降低[9]。METTL16作为最近新发现的一种m6A甲基化酶，在细胞内可结合mRNA核前体RNA(hnRNA)、非编码RNA(lncRNA)及U6核小RNA(U6snRNA)[10]。此外，RNA结合蛋白(RBM15)和含锌指CCCH型13(ZC3H13)等也参与到m6A甲基转移酶的组成[11]。Erasers即去甲基化酶，逆转m6A甲基化修饰，促进RNA去甲基化，包含FTO和ALKBH3[12],他们依赖Fe2+和α-酮戊二酸方式对m6A去甲基化修饰[13]。Readers是指识别并结合m6A位点，在细胞核或细胞质中发挥多种功能的蛋白质，包括YTH蛋白家族、IGF2BP、HNRNP家族和eIF3等[14],在体内主要的功能是识别并结合RNA上的m6A甲基化修饰，进而调节mRNA输出、翻译、降解等过程[15]。mRNA的m6A甲基化修饰是在不改变基因碱基序列的情况下对其转录后表达产物进行修饰，其作用与DNA的甲基化修饰相类似[16]。相关研究表明m6A甲基化修饰主要通过干预、调控mRNA和非编码RNA,进而影响基因的表达[17]。近年来RNA的m6A甲基化修饰在肿瘤细胞程序性死亡中成为热点。

1.2 m6A在RNA代谢中的作用

m6A通过添加、移除和识别参与到mRNA代谢的全过程，对mRNA剪接、输出、翻译和降解产生影响[18](图1)。mRNA前体(hnRNA)的剪接通过去除内含子并将外显子连接在一起的方式产生成熟的mRNA,YTHDC1通过识别m6A修饰并将SRSF3招募到mRNA前体上并将其剪接[19]。m6A结合蛋白HNRNP家族中的HNRNPC、HNRNPG也在mRNA前体的剪接发挥着重要作用[20,21]。mRNA前提经剪接后，成熟的mRNA需要m6A甲基化修饰才能从细胞核转运到细胞质。YTHDC1通过识别m6A修饰并将SRSF3招募到成熟的mRNA上，并传递给成熟的mRNA输出受体(NXF1),从而使核内m6A甲基化修饰的成熟mRNA转运到细胞质[22]。m6A甲基化修饰结合蛋白YTHDF1可与YTHDF3互相结合，并可与eIF3形成复合体，从而提高翻译效率[23]。m6A甲基化修饰在mRNA稳定性中起重要的作用，YTHDC2与XRN1(一种外切核糖核酸酶)互相结合，可以引起细胞质内含有m6A的mRNA的降解[24]。总之，m6A甲基化修饰可在mRNA的剪接、输出、翻译及降解发挥着调节作用，从而导致相关疾病的发生。

m6A修饰也是非编码RNA加工过程中不可或缺的一部分[25](图1)。m6A甲基化修饰可促进miRNA的成熟，HNRNPAZB1能与标记m6A的pre-miRNA识别，并且与DGCR8蛋白结合促进miRNA的成熟[26]。此外，miRNA也可以作为m6A甲基化修饰的调节分子促进肿瘤的发生发展，在胰腺癌(pancreatic cancer, CSC)中，METTL3的上调可以促进miR-25、pri-miR-25的成熟，而成熟的miR-25、pri-miR-25能抑制靶基因PHLPP2表达，从而导致AKT自噬信号通路的激活并促进癌症发生[27],为miRNA调控METTL3的机制提供了新的见解。目前的研究认为m6A甲基化修饰主要通过两种途径影响miRNA的合成和识别：m6A修饰通过促进miRNA合成影响肿瘤发展和miRNA可以作为m6A甲基化修饰的调节分子。在子宫内膜癌的小鼠实验中，SHEN等[28]发现YTHDF2通过介导lncRNA(FENDRR)的降解，从而提高盒转录因子4(cassette transcription factor 4,SOX4)在子宫内膜癌中表达水平，进而促进肿瘤细胞的增殖，m6A甲基化修饰可以改变lncRNA的稳定性进而影响肿瘤的发展。circRNA是一种独特的环状结构，m6A甲基化修饰的存在circRNA中，主要通过招募起始因子eIF4G2和m6A识别蛋白YTHDF3来促进蛋白质的启动[29]。综上所述，通过对m6A甲基化修饰对mRNA及非编码RNA的修饰的深入了解，未来可能作为肿瘤相关疾病的诊断标记物及治疗靶点。

1.3 m6A在不同癌症中的作用

RNA的m6A甲基化修饰不仅会影响许多生理学过程，在肿瘤的发生发展中也起着重要作用，异常的m6A修饰与癌症密切相关[25]。m6A甲基化转移酶与去甲基酶的可逆性调节及m6A识别蛋白与肿瘤相关疾病的发生逐渐成为研究热点[12,30]。METTL3蛋白表达的上调会促使急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)的发生[31],但在多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)中，METTL3的上调则会抑制肿瘤干细胞的增殖，起到抑癌的作用[32]。在结直肠癌(colorectal cancer, CRC)的相关研究中，RUAN等[33]发现缺氧可以形成缺氧肿瘤微环境，肿瘤微环境抑制一种m6A去甲基酶FTO的表达，从而导致被m6A甲基化修饰的肿瘤转移基因1(MTA1)表达增加，最终导致肿瘤细胞的生长及浸润。m6A修饰通过改变肿瘤相关mRNA基因的水平，进而影响下游致癌基因或抑癌基因的表达，提示m6A甲基化修饰可能为肿瘤的治疗开辟新的途径。

2、m6A甲基化与PCD的相关性

PCD是指细胞接受某种信号或受到某些因素刺激后，为了维持内环境稳定而发生的一种主动性死亡的过程。由于m6A最早是通过调节基因表达在细胞凋亡中被发现的，因此越来越多的研究表明m6A与几乎所有类型的PCD途径相互作用。作为一直以来的研究热点，PCD在癌症发病机制以及治疗中的作用正在进一步的被我们所理解，目前已知的PCD类型有十多种，以下主要介绍细胞凋亡、铁死亡、坏死性凋亡、细胞焦亡及细胞自噬在肿瘤细胞中的作用机制。

2.1 m6A甲基化与细胞凋亡

细胞凋亡(apoptosis)是研究较为广泛的一种细胞死亡方式，其三个具有特征性的生化事件为半胱天冬蛋白酶的激活、DNA和蛋白质的降解、线粒体外膜渗透性的改变。细胞凋亡的途径包括跨膜死亡受体介导的外源途径，以及在DNA损伤、生长因子缺失、化疗药物等刺激下由内质网介导的内源途径[34]。m6A主要通过四种机制诱导细胞凋亡：调控凋亡相关基因，沉默甲基化或去甲基化酶基因，以及减少YTHDF2基因的转录[35]。根据机器学习及GSEA分析，发现YTHDC2基因会提高SMC3目的基因的翻译效率，导致HNSCC中凋亡相关基因Bcl-2等显著升高，导致较高的存活率[36]。最近一项关于m6A的lncRNAs的研究中，LINC00942直接招募了m6A甲基转移酶复合物的核心成员METTL14,并伴随着乳腺癌(breast cancer, BRCA)细胞表观遗传m6A甲基化修饰水平升高，随后通过LNC942-METTL14-CXCR4/CYP1B1信号轴加速细胞增殖和集落形成，降低细胞凋亡率[37]。此外，另一项研究发现通过慢病毒感染去除FTO后，导致体内外乳腺细胞的凋亡[38]。这些研究表明m6A参与到细胞凋亡的过程中，可能作为疾病预后的评估标准。

2.2 m6A甲基化与细胞焦亡

细胞焦亡(pyroptosis)是一种由GSDMD介导的依赖Caspase的炎性程序性死亡途径，它的主要特征有炎症小体的形成、Caspase和gasdermin的激活以及大量促炎症因子的释放，涉及的基因有NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、p30、IL-1β和IL-18等[39]。细胞焦亡在对抗感染和内源危险信号中发挥重要作用，广泛参与感染性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病的发生发展。相关研究表明，张力蛋白同源蛋白(tensin homologous protein, PTEN)被认为是一种典型的肿瘤抑制因子，m6A甲基化修饰的PTEN mRNA通过参与PI3K/Akt/GSK-3β信号通路激活，可以下调焦亡相关蛋白NLRP3和ASC的表达[40],进一步保护机体细胞发生凋亡。最近有报道称METTL3介导的m6A参与糖尿病视网膜病变中的细胞焦亡，METTL3通过靶向激活miR-25-3p/PTEN/Akt信号通路，从而提高高糖环境中视网膜色素上皮细胞(RPE)的细胞活力[41],这一发现为将来未来的DR治疗带来新的机遇。在动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)疾病中，m6A甲基化修饰在IFN调节因子-1(IRF-1)诱导的巨噬细胞的焦亡中也起着关键作用[42]。因此，以上相关研究为m6A和凋亡相关成分之间建立了重要的桥梁，表明m6A对mRNA和非编码RNA的修饰通过影响NLRP3、ASC等的聚集在细胞凋亡中发挥重要作用。

2.3 m6A甲基化与铁死亡

铁死亡(ferroptosis)是一种铁依赖性的磷脂过氧化作用驱动的促炎程序性细胞死亡方式，在清除肿瘤细胞方面起着关键作用，铁死亡发生的经典机制是抑制xCT/GSH/GPX4[43]。在研究外泌体miRNA控制非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)顺铂耐药中的作用时发现，肿瘤细胞周围组织中外泌体miRNA显著升高，进一步研究发现，miR-4443通过METTL3来降低FSP1的m6A修饰水平，可以抑制铁死亡的发生[44],这一发现为顺铂治疗肺癌提供了机会。在肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD)细胞中，YTHDC2被发现可作为促进铁死亡的内源性因素，它通过识别HOXA13 mRNA中的m6A位点降低了其稳定性，从而降低SLC3A2(参与YTHDC2调控的铁死亡)的表达，进一步抑制LUAD的抗氧化性，从而限制肿瘤的进展[45]。这些研究将m6A与铁死亡联系起来，靶向m6A诱导铁死亡可能是一种有前景治疗肿瘤疾病的策略。

2.4 m6A甲基化与坏死性凋亡

坏死性凋亡(necroptosis)是一种由RIP1和RIP3激酶介导的程序性细胞死亡方式，通常由细胞内外的损伤引起，如TNF-α、Fas配体和ROS产物。坏死性凋亡的形态学特征表现为胞质空泡化、细胞器肿胀和膜破裂，释放损伤相关分子发挥功能等，其形态学特征可以建立一个癌症的免疫原性微环境[46]。LAN等[47]人最近在对大肠癌(colorectal cancer, CRC)患者肿瘤微环境(TME)中研究时，发现浸润的M2-TAMs增加了由METTL3介导的TRAF5(坏死性凋亡关键亚基)的m6A水平，使得细胞坏死性凋亡过程受损，最终导致抗肿瘤药的耐药性。以上研究为肿瘤细胞逃避坏死性凋亡提供治疗策略。

2.5 m6A甲基化与自噬

细胞自噬(autophagy)是近几年发现的一种新型PCD途径，对细胞内物质进行周转的保守代谢过程，细胞自噬是一种由溶酶体介导的细胞程序性死亡方式，又称Ⅱ型程序性细胞死亡，受到自噬相关基因(ATGs)的严格调控。根据进入溶酶体的方式，自噬可以分为三大类：微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaphrone-mediated autophagy, CMA),其中以巨自噬、分子伴侣介导的自噬研究较多，而微自噬相关研究减少[48],细胞外或细胞内的刺激通过自噬水平异常、抑癌基因的下调激活自噬，它在细胞死亡信号通路的调节中发挥着双重作用，既可在特定环境下促进生存，又可能在某些疾病中加速死亡。m6A和细胞自噬的影响是相互的，相关研究表明FTO可以去除ULK1基因(调控自噬的开关)转录的m6A甲基化，促使细胞自噬的发生等[49]。YANG等[50]人在小鼠体内观察m6A对黑色素瘤的影响时，发现通过下调自噬基因ATG5或ATG7,会降低FTO的表达以及NF-κB的活性，表明上调的FTO促进黑色素瘤的发生是由自噬和NF-κB通路诱导的。综上所述，自噬和m6A甲基化修饰之间的相互作用，在机体不同的状态下可能发挥不同的功能。

综上所述，m6A甲基化修饰在调节各种肿瘤程序性细胞死亡中起着“双刃剑”的作用，可能与m6A识别蛋白和非识别蛋白及其结合的位置有关。因此明确m6A甲基化修饰参与PCD的途径，可能为肿瘤的防治提供诊疗方案。

3、m6A通过PCD途径与肿瘤

m6A甲基化修饰可以调控各种PCD途径，而PCD又与癌症的发生发展密切相关，因此，基于m6A对PCD的双向调控，m6A通过PCD途径在各种癌症疾病中也是“双刃剑”一样的存在。

3.1 m6A通过PCD途径促进肿瘤的发生

在分子水平上，通过RT-qPCR测定和蛋白质印迹技术分别验证了RNA干扰对mRNA和蛋白质水平的影响(表1)。在AML的研究中，METTL3的过表达增加了C-MYC、Bcl-2、PTEN蛋白和未分化细胞的富集，减少了急性髓样白血病细胞凋亡，研究表明可以通过抑制METTL3来诱导细胞凋亡[51]。此外，FTO还可以抑制全反式维甲酸(ATRA)介导的AML细胞分化，降低ATRA的治疗效果，这些研究表明为METTL3在急性髓样白血病中的治疗靶向提供了理论依据。在胃肠道肿瘤中，METTL3抑制Bax和活性Caspase-3的表达，并促进Bcl-2的合成，胃癌细胞中细胞凋亡途径被抑制[52],提示METTL3可能是治疗胃癌(gastric cancer, GC)的潜在靶点。WANG等[53]对BRCA组织研究时，发现METTL3敲除可以降低甲基化水平，加速细胞凋亡进而抑制肿瘤生长。此外，还发现Bcl-2作为METTL3的靶点，从而调节BRCA的增殖和细胞凋亡。对CRC的研究表明，M2极化TAM通过提高细胞中METTL3介导的m6A修饰抑制CRC坏死性凋亡，促进奥沙利铂的耐药[47]。在HCC的研究中，YTHDF1通过与m6A修饰的ATG2A和ATG14 mRNA结合，促进自噬相关基因ATG2A和ATG14的翻译，从而促进自噬和自噬相关的HCC恶性肿瘤的发生[54]。因此，METTL3、YTHDF1等甲基化修饰蛋白可能成为肿瘤细胞发生和转移的标志，探索与m6A甲基化修饰有关的程序性细胞死亡方式，将有助于确定致癌的发病机制。

3.2 m6A通过PCD途径抑制肿瘤的发生

m6A修饰对Bcl-2的表达有不同的影响，这取决于肿瘤细胞所处的环境不同(表1)。FTO水平的增加上调了AML细胞中Bcl-2的表达，FTO和ALKBH5上调引起的Bcl-2过表达可促进细胞凋亡，从而导致对酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的敏感性[55]。在肺癌的研究中，研究发现METTL3和YTHDC2均为铁死亡诱导剂，前者其作用机制是METTL3通过高顺铂对NSCLC的治疗效果[44],后者其作用机制是YTHDC2通过在m6A修饰中抑制SLC7A11(铁死亡重要功能亚基)依赖性抗氧化功能来诱导铁死亡，进而抑制LUAD肿瘤发生[45]。在NSCLC中，ALKBH5上调UBE2C基因的表达，提高了自噬表型，并显著控制了肿瘤细胞的生长，揭示了自噬基因的激活在细胞自噬和凋亡中的作用[56]。m6A和PCD在肿瘤发生和发展过程中的相互作用的研究，不仅有助于了解癌症表观基因组，而且有助于确定抗癌靶点。然而，目前大部分研究集中在m6A修饰异常和修饰酶的功能与疾病的关联上，对于修饰酶本身的调控需要进一步研究。

表1 m6A通过PCD途径与肿瘤

4、以m6A通过PCD途径为靶点在肿瘤诊疗方面的潜在意义

最新研究表明，m6A修饰因子在肿瘤疾病的发生中普遍失调，可能与m6A添加、移除和识别的基因表达水平异常有关[57]。鉴于m6A调节蛋白与癌症中细胞凋亡、坏死性凋亡、铁死亡和细胞自噬之间的联系，详细阐述它们在病理过程中的相互作用将有助于发现特定的潜在生物标志物和治疗靶点，用于发现癌症诊断、治疗和预后评估(表2)。

表2 m6A和PCD在临床上的应用

4.1潜在的诊断生物标志物

在前列腺癌(prostate cancer, Pca)的研究中，LI等[58]通过免疫沉淀(MeRIP)测序、mRNA测序、RT-qPCR和生物信息学分析方法，筛 选并验证LHPP和NKX3-1被确定YTHDF2和METTL3的直接目标，当YTHDF2或METTL3敲除后，LHPP和NKX3-1 mRNA水平显著升高并触发细胞凋亡，这一发现可能有助于扩大前列腺癌潜在的诊断或治疗标志物的范围。在卵巢癌(ovarian cancer, OC)的研究中circRAB11FIP1过表达增强ATG5和ATG7 mRNA的m6A去甲基化，通过FTO促进细胞自噬[59],表明circRAB11FIP1可能作为OC诊断和治疗的生物标志物。在对BRCA的潜在调节机制研究中，发现LINC00942(LNC942)在促进METTL14介导的m6A甲基化中靶基因CXCR4和CYP1B1促进细胞增殖，抑制细胞凋亡[60]。因此，LNC942-METTL14-CXCR4/CYP1B1信号轴在BRCA的早期诊断、治疗和预后评估中发挥作用。

4.2治疗方面潜在的意义

去甲基化酶ALKBH5是主要的m6A RNA去甲基化酶，它与许多生物学和病理生理过程有关，在骨肉瘤的研究中，发现在骨肉瘤细胞中ALKBH5表达下调时，pre-miR-181b-1和YAP-mRNA的m6A甲基化表达上调，促进了骨肉瘤细胞的生长、迁移和侵袭，抑制了细胞凋亡[61]。因此，ALKBH5过表达可能被认为是骨肉瘤治疗的一种新的替代疗法。ZHOU等[36]人在对506名患者头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)中的基因改变特征和预后分析研究时发现，高YTHDC2蛋白表达的患者具有较高的生存率(OS)。甲基化转移酶METTL3与多种癌症的增殖及侵犯相关，HE等[62]发现SEC62的消耗阻碍了胃癌细胞的增殖并促进了细胞凋亡，其机制是miR-4429可能通过调控METTL3甲基化修饰抑制SEC62的表达，提示miR-4429及其下游基因METTL3是胃癌防治的潜在靶点。

4.3预后方面潜在的意义

AML是一种异源性疾病，WTAP是一种在许多生理和病理过程中起作用的核蛋白。通过采集AML患者的外周血或骨髓样本，发现WTAP调节AML细胞的增殖、肿瘤发生、细胞周期和分化。进一步的研究，发现WTAP可作为AML不良预后的预测因子[63],WTAP蛋白的高表达提示AML预后不良。LIU等[64]在对LUSC的研究时，通过数据挖掘癌症TCGA数据库，确定了FTO作为LUSC的预后因素，FTO降低了m6A水平和mRNA稳定性，导致MZF1表达增加，从而促进肿瘤的发生及发展。此外，FTO缺失可显著促进L78和NCI-H520细胞的细胞凋亡，抑制其增殖和侵袭。这一发现支持了FTO作为一个潜在的预后因素和治疗靶点。

5、小结与展望

m6A由m6A甲基转移酶组装，被读取蛋白识别，并被m6A去甲基酶消除，m6A甲基化修饰可以调节更多的PCD途径，新的m6A调节剂仍需我们研究发现。虽然m6A甲基化修饰及PCD在许多疾病中作为诊疗靶点，但是结合现有研究，以下问题还有待进一步研究：①m6A甲基化修饰是一个动态可逆的过程，如何使甲基化转移酶与去甲基化酶协调，可能接下来需要深入研究的问题；②m6A对PCD的调节既可以是促进的，也可以是抑制的，其作用机制不明确，这可能与m6A对mRNA的状态功能和生理环境以及上/下游调控的影响有关，但是可以确定的是，m6A修饰在多种疾病中通常都会表现出异常；③本文列举m6A甲基化调节因子可能只是其中的一小部分，未来m6A甲基化调节因子可以用作肿瘤早期筛查或预后还有待进一步深入研究。随之分子生物技术及单细胞测序的快速发展，对m6A修饰通过PCD途径与肿瘤的深入研究将有利于发现肿瘤潜在的生物标志物和治疗靶点，对疾病的诊断、治疗和预后评估，以及耐药性都非常有意义。

基金资助:河南省科技攻关计划(编号:212102311136);河南中医药科学研究专项课题(编号:20-21ZY1010);

文章来源:唐月,柴欣,李析濛等.m6A甲基化与肿瘤细胞程序性死亡的研究进展[J].现代肿瘤医学,2023,31(22):4245-4251.