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mTORC1在EB病毒LMP1促进DLBCL细胞母细胞化的研究

2024-01-29 132 上传者：管理员

摘要：目的:研究通过mTORC1通路EB病毒LMP1诱导弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞母细胞化的可能机制。方法:采用Western blot法分析EBV+及EBV-DLBCL细胞株LMP1蛋白、CD38的表达及p70S6K磷酸化情况。构建过表达LMP1稳转株及RNAi沉默LMP1基因，用RT-qPCR验证基因表达，并利用Western blot法检测各组细胞LMP1蛋白、CD38的表达量及较EBV- p70S6K磷酸化水平。结果:相较于EBV- DLBCL细胞，LMP1蛋白在EBV+DLBCL细胞上表达(P=0.0008),EBV+DLBCL细胞p70S6K磷酸化水平更高(P=0.0072)及CD38的表达量更高(P=0.0091)。与空载组对比，LMP1OE组的LMP1蛋白表达及CD38表达量均增高(P=0.0353;P<0.0001),且p70S6K磷酸化水平增高(P=0.0065);并验证了LMP1 mRNA表达(P<0.0001)。较si-NC组，LMP1KO组不表达LMP1蛋白(P=0.0129),且p70S6K磷酸化消失(P=0.0228);同时，CD38表达量减少，但无显著性差异(P=0.2377)。结论:LMP1通过活化mTORC1通路促进DLBCL细胞浆母细胞化。

关键词：
CD38
EB病毒
mTORC1通路
弥漫大B细胞淋巴瘤
浆母细胞化
潜伏膜蛋1
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非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin lymphoma, NHL)继发自身免疫性溶血病(autoimmune hemolytic anima, AIHA)的机率为3.9%-16.8%[1,2],弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是NHL最常见的一种亚型，在亚洲地区，约有14%的DLBCL患者检出EB病毒(epstein-barr virus, EBV)感染[3]。EBV为DNA病毒，属于Ⅰ类致癌物，人群感染率高，常以潜伏形式感染人体的上皮细胞和B细胞，潜伏感染时在被感染细胞内不增殖，只表达小部分基因或蛋白，其中，潜伏膜蛋白1(Latent membrane protein 1,LMP1)出现在大多数EBV+ DLBCL中，可通过抑制1-磷酸鞘氨受体2(Sphingosine-1-phosphate receptor 2,S1PR2)抑制肿瘤细胞凋亡[4,5]。但EBV表达的LMP1蛋白介导DLBCL继发AIHA的具体机制尚不清楚，本研究旨在初步探讨LMP1如何影响B细胞向高表达CD38的浆母或浆细胞转化，为阐明EBV+DLBCL继发AIHA的作用机制提供前期实验依据。

一、材料和方法

试剂与仪器

RPMI1640培养基及胎牛血清(美国Gibco公司);LipofectamineTM3000转染试剂(美国Invitrogen公司);小干扰RNA由广州锐博生物科技有限公司合成；3种包装质粒及过表达LMP1(经查询网址https: //www.ncbi.nlm.nih.gov),获得LMP1基因序列(ID:3783750),并添加Kozak序列(表1)重组质粒购自福州载基生物公司；RNAeasyTM动物RNA抽提试剂盒(上海碧云天公司);Rever Tra AceqPCR RT Master Mix with gDNA remover(日本Toyobo公司);TB GreenPremix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(日本Takara公司); RT-qPCR引物由深圳华大基因科技有限公司合成；蛋白酶抑制剂(美国Bimake公司);磷酸酶抑制剂(美国MCE公司);蛋白提取及Western blot相关试剂(上海碧云天);ECL显影液(武汉博士德公司);兔抗人LMP1(美国MyBioSource公司);兔抗人p70S6K(美国CST公司);鼠抗人p-p70S6K(美国CST公司);兔抗人CD38(美国CST公司);过表达LMP1慢病毒浓缩液(福州载基生物公司);Histrans G病毒感染增强液(上海吉凯基因);嘌呤霉素(北京索莱宝科技有限公司)。数显式稳压稳流电泳仪、全能型半干转膜仪均购自美国Bio-Rad公司，多功能酶标仪购自瑞士Tecan公司，细胞培养箱、微量分光光度计均购自美国赛默飞公司，实时荧光定量PCR仪购自中国天隆公司，倒置荧光显微镜系统购自日本Nikon公司。

细胞培养、慢病毒感染及转染

细胞培养DLBCL细胞株SUDHL-2及SUDHL-6为福建医科大学附属协和医院中心实验室保存，均在含20%胎牛血清的RPMI1640完全培养基中，置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。

过表达LMP1基因慢病毒感染感染当日，取处于对数生长期的SUDHL-6细胞以每孔1×105细胞接种于24孔板，每孔体积为250 μl, 融合度为80%。加入130 μl(最佳感染复制指数MOI值为130)的浓缩慢病毒，并加入20 μl Histrans G病毒感染增强液，将24孔板用封口膜密封，后放入平角离心机中，室温、1 000×g水平离心1 h, 尔后将培养板放在37 ℃,5% CO2温箱中培养；感染12 h后补充完全培养基250 μl, 并置于培养箱继续培养；感染 48 h后，将细胞转移至6孔板继续培养，另加完全培养基1 ml, 感染72 h可以观察到荧光(80%细胞产生荧光);72 h后，用含有终浓度为2.5 μg/ml嘌呤霉素的培养基筛选感染过表达LMP1慢病毒的细胞继续培养，当有大量细胞死亡时，可以把药物浓度减半维持筛选。筛选10-14 d后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后，提取总RNA及蛋白，鉴定稳转株。

转染感染当日，将SUDHL-2细胞株以每孔1×105细胞接种于6孔板，每孔体积为2 ml, 融合度为30%;按LipofectamineTM3000转染试剂操作说明书分别将si-NC、si-LMP1及si-GAPDH(siRNA序列详见表2)转染入细胞，将培养板放入37 ℃、5% CO2温箱中培养24 h后，提取总RNA及蛋白。

实验分组

验证表达差异将细胞分为EBV+细胞SUDHL-2及EBV-细胞SUDHL-6;过表达LMP1慢病毒感染分为空载慢病毒组(Vector)、过表达LMP1慢病毒组(LMP1OE)及阳性对照组(PC);siRNA敲除LMP1实验分为阴性对照组(si-NC)、敲除LMP1组(LMP1KO)及阳性对照组(GAPDHKO)。

RT-qPCR检测LMP1 mRNA的表达水平

采用离心柱式提取总mRNA,收集含1×106细胞悬液至去RNA酶的EP管中，按照说明书步骤操作即获得纯化RNA,并用微量分光光度计测定A260/280值及RNA浓度。按照操作说明书逆转录合成cDNA及进行RT-qPCR扩增，采用2-ΔΔCT法分析实验结果。以GAPDH表达水平作为内参，分析目的基因的相对表达量。

Western blot检测LMP1蛋白、p70S6K、p-p70S6K及CD38的表达

收集密度为1×106对数生长期细胞悬液2 ml, 室温、100×g 离心3 min, 弃上清，加入3 ml预冷PBS清洗，重悬混匀，室温、150×g离心3 min, PBS洗涤重复2次，加入适量新鲜配制的裂解液(按RIPA:蛋白酶抑制剂：磷酸酶抑制剂：PMSF=100∶1∶1∶1比例配制),涡旋振荡混匀，冰上裂解30 min, 期间每隔10 min摇晃几下，4 ℃、12 000×g离心20 min。吸取上清至新的EP管中，并取2 μl用于蛋白定量。余液加1/4余液体积的5×SDS上样缓冲液(含β-巯基乙醇),100 ℃金属浴煮10 min变性，-80 ℃保存。蛋白定量按碧云天产品BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行。取20 μg变性蛋白样品于含5%浓缩胶及10%分离胶的SDS-PAGE胶中分离后，转移至0.22 μm的PVDF膜上，含10%牛奶(或BSA)室温下置于摇床上(转速为 5×g)封闭2 h, 孵育相应一抗(按相应说明书用一抗稀释液稀释),4 ℃下置于摇床上(转速为5×g)过夜。用0.4% TBST洗膜3次，每次5 min。加入相应HRP标记的二抗(1∶1 000,0.4% TBST稀释),4 ℃孵育1 h。孵育结束后，室温下置于摇床上，转速为8×g,用0.4% TBST洗膜3次，每次5 min。加入适量ECL发光试剂，膜上反应1 min, 用凝胶成像仪曝光并拍照，用Gel-Proanalyzer 4图像软件分析结果。

统计学分析

采用GraphPad Prism 9.0 软件进行统计学分析，所有实验均独立重复3次，组间两两比较采用配对t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

EBV-、EBV+DLBCL细胞株LMP1蛋白、p70S6K、CD38分子表达差异

Western blot结果显示，相比于EBV-的SUDHL-6细胞，LMP1蛋白在EBV+SUDHL-2细胞上显著表达(P=0.0008),两者mTORC1复合物下游靶分子p70S6K蛋白表达水平相近，但SUDHL-2细胞p70S6K磷酸化水平高于SUDHL-6细胞(P=0.0072),且SUDHL-2细胞上出现CD38分子表达(P=0.0091)(图1)。

过表达LMP1基因慢病毒感染EBV-DLBCL细胞株并构建LMP1OE稳转株

采用三质粒包装体系构建过表达LMP1基因并携带GFP基因的慢病毒，在Histrans G病毒感染增强液辅助作用下，LMP1OE慢病毒成功感染EBV-DLBCL细胞株SUDHL-6(图2A),经嘌呤霉素筛选LMP1OESUDHL-6稳转株，并利用RT-qPCR验证LMP1OESUDHL-6稳转株中LMP1 mRNA的表达，LMP1OE组LMP1 mRNA的表达显著高于对照组及空载组(P<0.001)(图2B)。

过表达及沉默LMP1基因对DLBCL细胞株p70S6K磷酸化水平与CD38表达的影响

Western blot结果显示，相比于空载基因慢病毒感染SUDHL-6细胞株，过表达LMP1基因的SUDHL-6稳转株中表达LMP1蛋白(P=0.0353)、p70S6K磷酸化水平增高(P=0.0065),并出现CD38分子表达(P<0.001)(图3A)。利用siRNA技术敲除EBV+SUDHL-2细胞的LMP1基因后，Western blot结果显示，与si-NC组比较，LMP1KOSUDHL-2细胞未检测到LMP1蛋白表达(P=0.0129),p70S6K磷酸化现象消失(P=0.0228);CD38分子表达减弱，但差异无显著性统计学意义(P=0.2377)(图3B)。

三、讨论

LMP1由一个亲水性N-末端胞质区、6个疏水性跨膜区和一个亲水性C-末端胞质区构成，通过招募细胞内肿瘤坏死因子受体相关因子(TNF receptor-associated factor, TRAF),进一步激活下游多个信号通路[6],哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)可能为下游靶分子之一[7]。mTOR是一种分子量为289 kDa的丝氨酸/苏氨酸激酶，广泛存在于溶酶体、内质网、高尔基体、线粒体、细胞核和细胞膜，因不同的亚细胞定位发挥不同生物学功能[8,9]。本研究在EBV阳性(EBV+)DLBCL细胞株SUDHL-2中检测到LMP1蛋白表达，并且mTORC1下游靶蛋白p70S6K的磷酸化水平增高(P=0.0072),表明，mTORC1为LMP1靶分子。mTORC1是由mTOR分子组成的复合物之一，S2448位点磷酸化后引发核糖体蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase, S6K)(T389)磷酸化，可能导致免疫球蛋白合成的增多；也可能通过抑制周期蛋白依赖性激酶抑制剂的作用，细胞周期顺利跨过检查节点进入G2期，继而使高表达CD38的浆母细胞或浆细胞增多[10,11,12];同时，mTORC1可能通过调节线粒体氧化磷酸化功能影响活化B细胞停留在生发中心B细胞阶段或进一步向浆母细胞分化进程，转录后事件也可能参与决定活化B细胞的分化命运[13,14]。文献报道，在正常B细胞内，mTORC1可能先通过增强糖酵解而后促进B细胞的活化、增殖、分化，完成浆母细胞化过程[15,16]。CD38在活化B细胞上不表达，但在浆母细胞或者浆细胞上高表达，且兼具受体及胞外酶特性，其受体特性与免疫细胞的分化、免疫抑制及信号通道传导有关；而酶特性主要表现在对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)的水解，导致免疫抑制副产物的产生。既往研究发现自身免疫性疾病患者B和T细胞上CD38的表达增高[17]。本研究在SUDHL-2细胞中检测到CD38表达，SUDHL-6细胞中却未检测到该分子表达(P=0.0091)。

文献报道，预后较差的DLBCL患者肿瘤细胞存在CD38的高表达[18],本研究结果与文献报道一致，但该文献未深入研究DLBCL细胞上高表达CD38的致病机理。浆母或浆细胞因具备合成及分泌抗体的功能，细胞内的内质网体系含量丰富，若内质网中未折叠蛋白堆积过多，则引发未折叠蛋白反应(unfolden protein response, UPR),CD38则发挥其受体通道特性，内质网上钙离子通道开放，完成蛋白正常折叠[19,20]。本研究不仅初步揭示LMP1蛋白可能是借助mTORC1信号轴促使p70S6K磷酸化，导致DLBCL细胞完成母细胞化的假说，而且通过LMP1基因过表达和沉默的正反验证实验为假说奠定体外实验的基础。在利用siRNA技术沉默LMP1基因后，虽CD38分子表达减弱，但较沉默前无显著性差异(P=0.2377),可能与siRNA技术的敲除效率仅能维持3-4 d, 而SUDHL-2的生长周期为2 d, 新生肿瘤细胞进一步削弱敲除效率，后续实验可利用shRNA技术敲除LMP1基因，重新验证CD38的表达。mTORC1通路引发母细胞化的更深入机制及与CD38 分子的上下游关系，尚待后续更多实验明确。

综上所述，EBV+DLBCL细胞中表达的LMP1蛋白可通过介导mTORC1通路活化调控肿瘤细胞上CD38分子的表达，LMP1蛋白可能与B淋巴细胞的母细胞化有关。本课题组未来将纳入更多与母细胞化相关的分子生物学指标或功能性实验，深入明确LMP1/mTORC1信号轴对EBV+DLBCL细胞母细胞转化的影响，LMP1有望成为EBV+DLBCL继发AIHA的预测指标。

参考文献:

[10]涂冬云,张猛,尹纹静,等.左旋门冬酰胺酶对伯基特淋巴瘤细胞株增殖､细胞周期及凋亡的影响.中华血液学杂志,2021,42(11):930-938.

基金资助:泉州市科技项目(2021N057S);泉州市高层次人才创新创业项目(2019C003R);

文章来源:高晶晶,朱雄鹏,王明泉等.mTORC1在EB病毒LMP1促进DLBCL细胞母细胞化的机制研究[J].中国实验血液学杂志,2024,32(01):219-224.