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植物同源域指蛋白6对肝癌Hep-G2细胞迁移能力的影响

2025-01-08 92 上传者：管理员

摘要：目的探讨植物同源域指蛋白6(PHF6)对肝癌Hep-G2细胞迁移能力的影响，为临床诊疗提供参考。方法根据癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析PHF6在人正常肝脏和肝癌组织的表达情况，以及其表达对300余例肝癌患者近十年生存率的影响。比较siNC组(转染PHF6无义序列)和siPHF6组(转染siRNA-PHF6)细胞PHF6 RNA表达水平，利用划痕和Transwell实验检测两组细胞迁移能力，通过实时荧光定量聚合酶链式反应检测两组细胞上皮间质转化(EMT)相关基因表达情况。结果 PHF6在肝癌患者中存在明显过表达现象，高表达PHF6患者存活率降低。转染48 h后，siPHF6组细胞中PHF6 RNA表达水平低于siNC组(P=0.0016)。划痕后12、24、48、72 h，siPHF6组细胞划痕距离均大于siNC组，siPHF6组细胞迁移数量小于siNC组。与siNC组相比，siPHF6组细胞神经钙黏蛋白(CDH2)、纤连蛋白(FN1)的表达水平均降低，CDH1的表达水平升高(P<0.0001、P<0.0001、P=0.0018)。结论沉默PHF6可显著抑制肝癌细胞的迁移和EMT进程，靶向PHF6治疗肝癌具有应用前途。

关键词：
HCC
上皮间质转化
植物同源域指蛋白6
肝癌
肝细胞癌
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肝癌是全球死亡率排名第三的癌症，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原发性肝癌的主要类型，占85%～90%[1-2]。目前，肝切除手术和肝移植能显著延长早期HCC患者的生存时间，但晚期患者复发率高、预后较差[3-4]。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮细胞转化为具有迁移能力的间充质细胞的过程。在这一过程中，上皮细胞逐渐失去黏附性，并明显表现出间充质细胞的特征，即细胞角蛋白Cytokeratins、上皮细胞钙黏蛋白(CDH1)等上皮细胞标志物的表达下调，神经钙黏蛋白(CDH2)、波形蛋白(Vimentin)、纤连蛋白(FN1)等间充质细胞标志物的表达增强[6]。癌症分子靶向治疗对治疗肝细胞癌具有重要临床意义。植物同源域指蛋白6(PHF6)是一种位于细胞核的染色质结合调节蛋白，具有转录调控功能。该基因位于人类染色体Xq26.3，属于X连锁基因，其突变在Börjeson-Forssman-Lehmann综合征中被发现[7-8]。PHF6几乎表达于所有组织，对神经发育和造血很重要。在造血干细胞中敲除PHF6，可增加细胞自我更新能力，驱动血癌发生，因此PHF6被认为是一种抑癌基因[9-10]。敲除PHF6损害细胞增殖使其停滞在G(2)/M期，表明PHF6缺乏导致细胞DNA损伤的积累[11]。然而，PHF6是否影响肝癌生长和转移及作用机制尚未报道。基于此，本研究探究PHF6对肝癌细胞Hep-G2迁移能力的影响。

1、材料和方法

1.1 细胞培养和分组

取Hep-G2肝癌细胞株(购自美国模式培养保藏中心)，在饱和湿度细胞培养箱内培养(5% CO2、 37 ℃)，培养基含有10%胎牛血清(FBS)(购自Sigma公司)和1%青链霉素的DMEM(购自Gibco公司)。细胞融合率达≥80%时用0.25%的胰酶(购自Gibco公司)37 ℃消化1 min后传代。实验分为siNC组(转染 PHF6无义序列)、 siPHF6组(转染siRNA-PHF6)，每组使用的细胞数均为8×104个/mL细胞，每组设置3组重复实验。

1.2 转染PHF6基因

将8×104个/mL Hep-G2细胞接种于6孔板，每孔2 mL培养液，培养8～12 h，融合率达40%进行转染实验。将转染试剂 Lipofectamine ® RNAiMAX Reagent (购自Invitrogen公司)9 µL稀释于150 µL Opti-MEM®Medium中，同时将2 µL(30 pmol)siRNA 储存液加入150 µL opti-MEM®Medium中混合，室温孵育5 min 后将二者混匀，4 ℃ 孵育15 min后滴加到对应孔中，培养6 h后更换培养液，24～48 h后进行后续实验。siRNA-PHF6核酸序列如下：正义链，5'-GGCCUACAAGACAGCGCAATT3'-；反义链：5'-UUGCGCUGUCUUGUAGGCCTT3'-，由金拓思(武汉)生物科技有限公司进行设计并合成。

1.3 划痕实验

将转染后的siNC组和siPHF6组细胞进行培养，细胞融合度≥90%时用10 µL枪头垂直划痕，随后用磷酸盐缓冲液(购自Gibco公司)清洗细胞，去除杂质和脱落的细胞，于培养0、 12、 24、 48、 72 h拍照记录相同位置细胞的迁移变化，统计不同组别间细胞迁移差异。

1.4 实时荧光定量聚合酶链式反应

在6孔板的每孔Hep-G2细胞中添加500 µL TRIzol裂解液(购自TAKARA)以提取RNA，随后测定提取RNA的浓度，并通过凝胶电泳实验对其质量进行检测。利用PrimeScriptTMII cDNA Synthesis Kit(购自TAKARA)进行反转录，稀释反转录产物cDNA，以此作为实时荧光定量聚合酶链式反应的模板。检测两组细胞基因表达变化，实时荧光定量聚合酶链式反应引物序列，见表1。反应条件：起始95 ℃、 5 min；随后变性温度为95 ℃，维持 15 s，退火温度为60 ℃，维持30 s，此过程共进行40个循环。根据2-△△CT方法计算基因表达差异，18S作为内参。

1.5 Transwell迁移实验

使用Transwell小室(孔径8 μm，购于Corning公司)进行迁移实验，转染后的细胞重悬于200 μL不含血清的DMEM溶液中，然后接种于上室。下室加入500 μL含10 % FBS的DMEM培养基作为催化剂。37 ℃孵育24 h后，将已迁移至下室的细胞用100%甲醇在室温下固定30 min，利用0.5%结晶紫溶液进行30 min染色。对染色细胞进行观察，显微镜拍照。

1.6 数据统计

使用GraphPad Prism 9软件对实验数据进行统计分析并绘图，数据表示为(mean±SEM)；两组间比较进行Student t-test分析；对癌症基因组图谱(TCGA)数据库中患者生存率进行对数秩检验分析。0.01<P<0.05标记为*，0.001<P<0.01标记为**，P<0.001标记为***，P<0.0001标记为****。

2、结果

2.1 TCGA数据库肝癌患者存活率分析

PHF6在肝癌患者中存在明显过表达现象，见图1-A；高表达PHF6患者存活率降低，见图1-B、图1-C。

表1 引物序列

图1 PHF6对肝癌患者生存率的影响

2.2 两组细胞PHF6 RNA表达水平比较

转染48 h后，siPHF6组细胞PHF6 RNA表达水平低于siNC组(P=0.0016)，见图2。

图2 两组细胞PHF6 RNA表达水平

注：PHF6：植物同源域指蛋白6。

2.3 划痕、Transwell实验结果分析

划痕后12、 24、 48、 72 h，siPHF6组细胞划痕距离均大于siNC组，见图3-A、图3-B。siPHF6组细胞迁移数量小于siNC组，见图3-C。

2.4 实时荧光定量聚合酶链式反应分析结果

与siNC组相比，siPHF6组细胞CDH2、 FN-1的表达水平降低，CDH1的表达水平升高(P<0.0001、 P<0.0001、 P=0.002)，见图4。

图4 实时荧光定量聚合酶链式反应分析结果

3、讨论

PHF6的体细胞功能突变在T细胞急性淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)中非常普遍，也存在于急性骨髓白血病(acute myeloid leukemia，AML)中，且敲除PHF6基因的造血干细胞(HSC)的重建和自我更新能力增强，这均表明PHF6可能是一种抗癌基因[12-14]。然而，PHF6在乳腺癌和结直肠癌中显著高表达，提示PHF6可能参与其他恶性肿瘤，本研究将探讨其在肝癌中的作用机制。

图3 划痕、Transwell实验结果

本研究结果显示，PHF6在肝癌患者中存在明显过表达现象，高表达PHF6患者存活率降低；转染48 h后，siPHF6组细胞中PHF6的RNA表达水平低于siNC组；划痕后12、24、48、72 h，siPHF6组细胞划痕距离均大于siNC组，siPHF6组细胞迁移数量小于siNC组；与siNC组相比，siPHF6组细胞CDH2、FN-1的表达水平降低，CDH1的表达水平升高。分析原因为，EMT是指上皮细胞失去相互连接和极性，转化为间质细胞的现象。这一过程的激活是上皮癌细胞获得恶性表型的核心机制，也是癌症转移和侵袭的重要环节[15]。因此，抑制EMT会干扰肿瘤的进展。敲低PHF6可能通过上调E-cadherin和下调N-cadherin和Fibronectin-1来抑制EMT过程，继而肝癌细胞Hep-G2细胞的迁移能力减弱。

此外，PHF6能招募组蛋白赖氨酸甲基转移酶SUV39H1至rDNA(核糖体DNA)区域，并借助SUV39H1的三甲基化酶活性来提升rDNA区域组蛋白H3的9位赖氨酸残基甲基化(H3K9me3)的水平，从而抑制rDNA转录。敲低PHF6则能够通过促进 rDNA的转录，进而增强细胞增殖和肿瘤生长[16]。但在T-ALL和AML的小鼠动物模型中，敲低PHF6后肿瘤增长速率却加快；而在小鼠的急性B细胞淋巴白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL)模型中，通过慢病毒技术敲低PHF6后，观察到肿瘤的增长速率显著减缓[17]。本研究证明敲低PHF6可抑制肝癌细胞的迁移，进而起到治疗肝癌的作用，但这是否也是PHF6作为转录因子调控表观遗传进程来实现的，仍需进一步研究。

综上所述，沉默PHF6可显著抑制肝癌细胞的迁移和EMT进程，靶向PHF6治疗肝癌具有应用前途。通过基因编辑技术降低PHF6的表达或开发PHF6的小分子抑制剂，特异性地降低PHF6的表达或功能，从而抑制肝癌细胞的生长和转移，可作为肝癌治疗的新思路。

参考文献:

[9]黄可秀.伴PHF6突变急性髓系白血病的临床结局研究[D].广州:南方医科大学,2023.

[10]郭腾霄.表观遗传因子CELF2和PHF6在MLL-AF9诱导的急性髓系白血病中的作用及机制研究[D].北京:北京协和医学院,2024.

[16]吴彦萍.PHF6和SUV39H1相互作用调节rDNA转录的机制研究[D].北京:清华大学,2019.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(编号:82103188);辽宁省科学技术计划项目(编号:2023-MS-325); 沈阳医学院大学生科研项目(编号:20249007);

文章来源:杨明妍,包欣玥,汪水莲,等.植物同源域指蛋白6对肝癌Hep-G2细胞迁移能力的影响[J].大医生,2025,10(02):45-48.