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针对K-Ras(G12C)突变肿瘤的还原响应型纳米胶束制备及评价

2024-12-19 61 上传者：管理员

摘要：目的以不同分子量的巯基化聚乙二醇和K-Ras（G12C）抑制剂6合成一系列还原敏感型高分子前药（PERI），制备并筛选出最优纳米胶束（PERIs胶束），考察其理化性质和体外抗肿瘤作用。方法通过二硫键将巯基化聚乙二醇与小分子抑制剂结合，得到还原敏感型PERIs高分子前药，通过其自组装制备PERIs胶束。透射电镜观察其形态；粒度仪测定其粒径和表面电位；芘荧光探针法测定其临界胶束浓度；间接法测定其载药量及包封率；透析法测定其在不同还原条件下的体外释药行为；采用CCK-8 法评价其细胞增殖毒性。结果核磁共振氢谱表明PERIs成功合成；PERIs胶束（Mw：2000）的平均粒径为（95.76±1.8）nm，多分散系数为（0.189±0.0084），Zeta电位为-（7.07±0.14）mV，临界胶束浓度为 0.875 μg•mL-1，载药量为（11.5±0.16）%，包封率为（71.6±0.83）%；体外释放度实验表明PERIs胶束具有还原敏感性；细胞毒性实验表明PERIs胶束对肿瘤细胞有较强的增殖抑制作用。结论制备的PERIs胶束（Mw：2000）粒径均一，分散性及稳定性良好，具有控释能力，并对肿瘤细胞有较强的增殖抑制作用。

关键词：
K-Ras(G12C)抑制剂6
前药纳米胶束
巯基化聚乙二醇
肉瘤基因
还原敏感
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大鼠肉瘤基因(rat sarcoma gene，Ras)家族中K-Ras突变最为常见[1]。Ras蛋白是Ras基因表达的产物，通过调节鸟嘌呤三核苷酸磷酸(GTP)与鸟嘌呤二核苷酸磷酸(GDP)的相互转化来调节细胞增殖分化[2]。Ras基因突变后，Ras蛋白构型发生转变，失去了调节能力，造成细胞不可控地增殖[3]。Ostrem等[4]发现了一种针对K-Ras(G12C)突变体的K-Ras(G12C)抑制剂6[K-Ras(G12C)inhibitor 6，RI]，其可以使Ras蛋白倾向于与GDP结合而处于失活状态，因此可大幅度降低含有K-Ras(G12C)突变的肿瘤细胞活性，并且加速其凋亡[5-6]。但RI不溶于水，在临床治疗过程中需要助溶剂增加其溶解度，而助溶剂会给机体带来严重不良反应，临床应用受限[7-8]。

纳米制剂能够改善传统化疗药物的生物利用度并将其通过被动/主动靶向递送至肿瘤部位，其中刺激响应型前药纳米制剂可避免使用大量助溶剂以及递送过程中发生药物渗漏所造成的严重不良反应，具有肿瘤微环境响应释药特性并具有较高的载药能力，备受研究者关注[9-11]。由于肿瘤细胞活跃地增殖生长，肿瘤细胞内谷胱甘肽(GSH)浓度比正常组织高100～1000倍[12]。二硫键是人体内重要的还原敏感型共价键，其在正常生理条件下非常稳定，但在高GSH浓度下易被还原成巯基而断裂[13]。因此，本实验选择有良好的水溶性、生物相容性和生物膜可渗透性的聚乙二醇(PEG)作为载体[14]，将RI通过二硫键偶联到巯基化聚乙二醇的末端，构建具有还原敏感的功能化纳米胶束(PERIs)，并对其理化性质和体外抗肿瘤作用进行评价。

1、材料

1.1试药

巯基化聚乙二醇、二硫二吡啶(纯度：98%)、二氯甲烷(分析纯)、磷酸盐缓冲液(PBS)粉末(上海阿拉丁科技)，RI(纯度>98%)、CCK-8试剂(大连美仑生物技术有限公司)，透析袋(索莱宝生物科技有限公司)，细胞培养皿(Corning Incorporated)，0.25%胰酶(含EDTA)、青霉素/链霉素双抗溶液(Hyclon)，96孔细胞培养板(Corning Incorporated)，二甲基亚砜(DMSO)(纯度>99.8%，Sigma-Aldrich)，RPMI-1640培养基、胎牛血清(FBS)(Gibco)，人非小细胞肺癌细胞H358、小鼠成纤维细胞L929(ATCC)。

1.2仪器

万分之一分析天平(瑞士Mettler-Toledo)，恒温摇床(上海一恒科学仪器)，核磁共振波谱仪(美国Bruker)，马尔文激光粒度仪(英国Malvern Nano-ZS)，紫外分光光度计(上海翱艺仪器)，酶标仪(美国Thermo Scientific)，透射电子显微镜(日本Hitachi)。

2、方法与结果

2.1高分子前药(PERI)的合成与表征

反应1：称取巯基化聚乙二醇(Mw：1000，1 g，1 mmol)加入50 mL反应瓶中，用5 mL DMSO溶解并加入200μL乙酸。称取二硫二吡啶(1.1 g，5 mmol)溶于5 mL DMSO中，在室温搅拌下缓慢加入反应瓶中，滴加完毕后继续搅拌反应5 h。反应完成后先后在DMSO和二氯甲烷中透析，然后旋蒸干燥得到二硫吡啶化聚乙二醇(PR)。

反应2：称取PR(Mw：1000，0.5 g，0.5 mmol)加入50 mL反应瓶中，用5 mL DMSO溶解并加入200μL乙酸。称取RI(0.4 g，1 mmol)溶于5 mL DMSO中，在室温搅拌下缓慢加入反应瓶中，滴加完毕后继续搅拌反应10 h。反应完成后先后在DMSO和二氯甲烷中透析，然后旋蒸干燥得到PERI，记为PERI(Mw：1000)。反应路线见图1，PERI(Mw：2000)，PERI(Mw：4000)，PERI(Mw：5000)均采用上述步骤合成得到。

PERI(Mw：2000)1H-NMR鉴定产物结果见图2，化学位移7～8中3个特征峰是RI苯环上3个氢的特征峰，8.03是RI仲胺氢的特征峰，合成原料及各步骤合成结果的核磁对比图表明目标产物PERI成功合成。

2.2标准曲线的建立

由于聚乙二醇和小分子抑制剂均无光学特性，而上述反应1和反应2有相同且单一的副产物2-吡啶硫酮，与反应产物以及原料的摩尔比均为1∶1，且在约375 nm波长处有吸收[15-16]，因此利用反应副产物的特性分别在370、375、380 nm处考察标准曲线的吻合程度。首先将抑制剂RI溶解在DMSO中，配制成质量浓度为1 mg·mL-1的溶液作为母液，将母液稀释成一系列含有抑制剂RI的DMSO溶液(2、5、8、10、15、20、25、30、35、40、50μg·mL-1)，然后分别加入二硫二吡啶按照反应1的步骤充分反应。反应结束后将反应液加入DMSO定容至1 mL，然后对吸光度进行检测，以抑制剂RI的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。根据R2值，375 nm波长处得到的标准曲线拟合度最好，线性方程为y=0.0056x-0.0003。

图1高分子前药PERI的合成路线

图2 PERI(Mw：2000)的核磁共振氢谱

2.3载药量(DL)及包封率(EE)测定

吸取500μL的终反应液，使用DMSO定容至1 mL，测定其吸光度，根据浓度与吸光度之间的函数关系式计算出副产物2-吡啶硫酮的量。副产物2-吡啶硫酮和RI的摩尔比为1∶1，通过以下公式计算高分子前药中RI的DL和EE，结果见表1。材料PERI(Mw：2000)和PERI(Mw：1000)的DL和EE均大于材料PERI(Mw：4000)、PERI(Mw：5000)，因此可初步定为候选材料。DL(%)=高分子前药中RI的含量/高分子前药的质量×100%；EE(%)=高分子前药中RI的含量/投入RI的质量×100%。

2.4粒径、电位及稳定性测定

超声法制备1 mg·mL-1的胶束溶液，通过动态光散射测试法对胶束的粒度进行表征。检测条件：温度为25℃，散射角173°，每个样品测定3次。将制备的1 mg·mL-1的胶束溶液转入37℃恒温箱中，在预设的时间点(1、2、3、4、5、6、7 d)取出并测定其粒径和电位，每个样品测定3次。结果如表1所示，4种材料的多分散系数显示粒径较均匀，只有PERI(Mw：2000)的粒径小于100 nm。稳定性测定结果如图3所示，4种材料均显示出较好的稳定性。综上，本实验选择粒径大小合适、Zeta电位稳定且载药量和包封率较高的PERIs胶束(Mw：2000)用于后续的研究。PERIs胶束(Mw：2000)的平均粒径为(95.76±1.8)nm，多分散系数为(0.189±0.0084)，表明其粒径均一，分散性良好。进一步测定PERIs胶束(Mw：2000)在含有10%FBS的(RPMI-1640)培养基中的粒径和Zeta电位稳定性(见图4)，其在培养基中仍具有较好的稳定性。

表1不同分子量PERIs胶束的物理性质对比结果(

2.5 PERIs胶束(Mw：2000)的形态测定

制备1 mg·mL-1的胶束溶液，稀释后滴到铜网上，磷钨酸负染后利用透射电镜(TEM)观察纳米胶束的形貌。结果见图5，PERIs胶束形态良好，分布均匀，呈现出规则的球形状，且未见相互粘连。

图3 4种胶束在7 d内的粒径(A)和Zeta电位(B)稳定性(

图4 PERIs胶束(Mw：2000)在RPMI-1640培养基中的粒径(A)和Zeta电位(B)稳定性(

2.6临界胶束浓度(CMC)的测定

图5 PERIs胶束(Mw：2000)的粒径分布(A)和TEM(B)图

通过芘探针荧光光谱法测定载药胶束的CMC。将冻干的胶束用少量DMSO溶解后，剧烈搅拌下加入适量芘水，避光敞口搅拌过夜制备得到一定浓度的胶束溶液。将该胶束母液用芘水稀释得到一系列浓度梯度的胶束溶液，然后用荧光光度计检测样品的荧光光度值。固定激发波长为334 nm，记录373 nm和384 nm处的荧光强度分别记为I1和I3。以373 nm和384 nm处荧光强度的比值I1/I3对PERIs胶束对数浓度作图，通过斜率的突变点确定PERIs胶束的CMC值。结果如图6所示，PERIs胶束的CMC为0.875 µg·mL-1。

图6芘探针在不同波长处荧光强度的比值

2.7体外释药行为测定

模拟还原环境[含10 mmoL·L-1二硫苏糖醇(DTT)的PBS，0.01 mol·L-1，pH 7.4]和非还原环境(不含DTT的PBS，0.01 mol·L-1，pH 7.4)，进行体外药物释放实验。分别取1 mL药物质量浓度为1 mg·mL-1的纳米胶束置于透析袋中，将其置于含有20 mL相应缓冲液的离心管中，每组设定3个平行样。将所有离心管放入37℃恒温摇床中，转速120 r·min-1，避光振荡。在预先设定的时间点从各组中取出5 mL缓冲液，并分别加入等量的相应新鲜缓冲溶液。最后将取出的所有样品通过高效液相色谱法测定其浓度[17]，再计算纳米胶束的累计释放量。结果如图7所示，PERIs胶束在非还原性条件下释药速率较慢，10 h后其释药量趋于稳定，仅释放约10%的药物；在还原性环境中的释药速率大为增加，10 h时释放约65%的药物，随着时间的延长，累计释放量可达约82%。这是由于该高分子前药的二硫键在DTT存在下发生断裂，造成胶束结构破坏，致使小分子抑制剂快速释放出来。

图7不同还原条件下小分子抑制剂的累计释放曲线(

2.8中间体PR的生物相容性实验

将对数生长期的H358细胞和L929细胞分别按照每孔5000个和2000个细胞的密度接种在96孔板中，置于37℃、5%CO2的孵育箱中孵育，24 h贴壁后吸去原有培养基，加入含有PR的新鲜培养基，孵育48 h，孵育之后每孔加入100μL含CCK-8的培养基，继续培养2 h，用酶标仪检测470 nm波长下的吸光度(OD)值，并计算细胞存活率，细胞存活率(%)=(OD样品-OD空白对照)/(OD阴性对照-OD空白对照)×100%。每组设置5个平行样。结果如图8所示，中间体PR对H358和L929细胞并未显示出系统毒性，即使在高浓度500μg·mL-1时，仍表现出一定程度的促增殖作用，表明其具有良好的生物相容性。

图8中间体PR与H358和L929细胞孵育48 h后的生物相容性(

2.9纳米胶束的体外抗增殖实验

将对数期生长的H358细胞按照每孔5000个细胞的密度接种在96孔板中，置于37℃、5%CO2的孵育箱中孵育，24 h贴壁后吸去原有培养基。加入含有载药胶束溶液的新鲜培养基，孵育48 h，孵育之后操作方式及计算方式同生物相容性实验。结果如图9所示，PERIs胶束的毒性随着抑制剂RI浓度的增加而增强，说明其在肿瘤细胞内能释放出RI抑制肿瘤细胞增殖且呈现出浓度依赖性。

图9 RI和PERIs与H358细胞孵育48 h后的细胞存活率(

3、讨论

近年来，一些新的药物递送系统，包括脂质体[18]、纳米粒[19]、胶束[20]等，被用于不同药物的体内递送。随着研究的深入，为了使载体更加的智能化，针对刺激响应性载体的研究更是百花齐放，如pH[21]、酶[22]、光[23]、温度[24]等，然而真正应用到临床的却寥寥无几，因此本实验回归临床转化的初心，选择安全性良好、研究较为成熟的PEG作为药物载体，期望能为从开发到临床转化提供实验基础。研究显示粒径在60～100 nm的胶束更有利于通过高渗透长滞留效应增强药物在肿瘤的聚集[25]，胶束表面负电荷可以防止胶束间的聚集，避免蛋白吸附，增加体内稳定性，延长体内循环时间[26]，因此在PERIs胶束(Mw：1000)和PERIs胶束(Mw：2000)的载药量及包封率相近的情况下，选择粒径小于100 nm的PERIs胶束(Mw：2000)用于后续研究。通常，CMC越低，在相同浓度下，形成的胶束浓度越高，难溶性药物的载药量越多。而且较低的CMC使胶束溶液具有更好的稀释稳定性。PERIs胶束(Mw：2000)具有较低的CMC，表明其具有优良的载药性能和稳定性[27]。

PERIs胶束(Mw：2000)表征结果显示，其粒径大小合适且均一，有利于增加肿瘤部位药物浓度，提高抗肿瘤效果；表面带负电荷，有助于延长体内的循环时间；药物释放实验显示其在高还原性肿瘤细胞内能够实现有效的药物释放；L929细胞实验显示中间体PR具有良好的生物相容性，可以作为一种安全无毒的载体负载药物；抗增殖体外研究结果表明其可高效递送小分子抑制剂，显著抑制K-Ras(G12C)突变的H358细胞的增殖。PERIs胶束[IC50为(5.79±0.087)μg·mL-1]的细胞毒性小于RI[IC50为(4.72±0.058)μg·mL-1]，可能由于纳米胶束经过胞吞途径入胞，入胞后需进一步裂解二硫键释放出游离药物，而游离药物则可通过被动扩散入胞，入胞后直接发挥作用。正因为如此，游离药物因其对机体无选择性攻击而造成的严重不良反应大大限制了其临床应用。

该纳米药物递送体系PERIs兼具被动靶向和还原响应控释性能，为小分子抑制剂的靶向输送提供了新的策略，然而本实验在载药量方面仍需提高，体内抗肿瘤效果仍需验证，下一步将从体内抗肿瘤效果评价、联合化疗及分子机制方面进行更加深入全面的研究。

基金资助:信阳市软科学研究计划项目(No.20230068);

文章来源:卢贵茹,刘阳,刘晶阳,等.针对K-Ras(G12C)突变肿瘤的还原响应型纳米胶束的制备及评价[J].中南药学,2024,22(12):3156-3161.