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分析胃癌免疫基因组学分型及其特征

2020-06-30 315 上传者：管理员

摘要：目的通过基因组学分析建立胃癌免疫分型，并进一步探讨其免疫特征。方法从TCGA数据库下载443例胃癌患者的基因表达谱及生存数据，通过单样本基因集富集分析(ssGSEA)评分对患者进行分组;采用ESTIMATE及CIBERSORT分别评估各样本中免疫微环境及免疫细胞的组成;采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线并对组间差异进行Log-rank检验。结果根据免疫评分将患者分为高、中、低免疫组，三组间预后具有统计学差异;高免疫组所包含的免疫细胞和基质细胞数量最多，肿瘤纯度最低; HLA基因及PD-L1、PD-L2、PIK3CA表达明显增高;高免疫组中CD8+T细胞含量最高，而M0巨噬细胞和幼稚B细胞最少。结论胃癌免疫分型有助于判断患者的预后，高免疫组患者具有较高的免疫原性及抗肿瘤免疫活性。

关键词：
CIBERSORT
免疫分型
免疫检查点抑制剂
基因组学
肿瘤
胃癌
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胃癌是全球死亡率排名第三的癌症，在我国的年患病率和死亡率是世界平均水平的2倍，且近年来死亡率仍呈上升趋势[1]。早期胃癌在诊断、手术切除和辅助治疗等方面取得了诸多进展，但晚期或难治性胃癌的治疗选择仍十分有限，近年来免疫检查点抑制剂(Immune Checkpoint Inhibitors,ICIs)，尤其是抗PD-1/PD-L1抗体，在多种肿瘤的治疗中取得了前所未有的持久性疗效[2]。然而抗PD-1抗体治疗晚期胃癌的单药有效率仅波动在10%～20%之间[3]。胃癌是一种异质性疾病，具有多种专业分型，在组织学上具有Lauren分型和WHO分型[4]，随着基因组技术和高通量分析的发展，癌症基因组图谱研究网络(TCGA)将胃癌分为EBV阳性、微卫星不稳定(MSI)、基因组稳定和染色体不稳定(CIN)四种亚型[5]。这些分型对胃癌的诊断、治疗及基础研究具有重要的生物学和临床意义，然而目前尚无基于免疫组学的分型研究。为进一步提高ICIs在胃癌中的疗效，我们采用免疫基因组分析将胃癌分为三型，并进一步分析各型的免疫特征，旨在通过本研究为判断患者的预后和治疗反应提供理论依据。

1、材料与方法

1.1数据采集

本研究从TCGA数据库(https://cancergenome.nih.gov/)下载了443例胃癌患者肿瘤和正常组织的基因表达谱及相应临床数据。纳入研究的患者没有特殊的排除标准，每个肿瘤组织对应一个患者。

1.2聚类分析

通过单样本基因集富集分析(ss GSEA)按照免疫基因组功能定义29个免疫标志的基因集[6]来量化每个胃癌样本中基因集的富集水平并排序[7]。采用Elbow法和Gap统计量相结合的方法，决定聚类的分组数量并进行聚类分析[8]。

1.3肿瘤成分评估

采用CIBERSORT分析工具(https://cibersort.stanford.edu)，通过反褶积算法推断不同样本中22种肿瘤浸润免疫细胞的组成比例[9]。使用ESTI-MATE(Estimation of STromal and Immune cells inMAlignant Tumors using Expression data)方法评估各个样本的免疫评分、基质细胞含量及肿瘤纯度[10]。

1.4统计分析

总生存期(Overall Survival,OS)定义为自确诊开始至任何原因引起死亡的时间间隔，通过KaplanMeier曲线分析各个亚组与OS之间的关系，并采用Log-rank法进行检验。所有分析均使用R软件(3.5.2版本)进行，所有统计均为双侧检验，P<0.05定义为有统计学差异。

2、结果

2.1病例特征

本研究共包括443例胃癌患者，其中男性285人(64.3%)，女性158人(35.7%)，平均年龄65.7岁(30～90岁)。具体临床病理特征见表1。

2.2免疫分型的生存分析及免疫评分

通过ss GSEA分析29个免疫相关基因集来量化胃癌样本中免疫细胞、功能或相关通路的活性及富集水平，依照基因表达倍数改变降序排列并进行评分[6]，进一步对评分进行聚类分析并将患者分为三组:高免疫组、中免疫组和低免疫组。三组间生存率具有统计学差异(P=0.043)，低免疫组的生存预后优于高免疫组和中免疫组(图1)。ESTIMATE分析发现从低免疫组到高免疫组，免疫及基质评分逐渐增加，而肿瘤纯度逐渐降低，三组间具有明显统计学差异(P<0.001，图2)。

2.3各免疫分型中HLA及胃癌相关基因的表达

通过分析胃癌中免疫相关基因、易感基因及预后不良基因在各亚组中的表达，发现从低免疫组到高免疫组，E型钙粘附蛋白(E-cadherin,CDH1)及人类表皮生长因子受体2(ERBB2/Her2)表达逐渐降低，PD-L1、PD-L2、PIK3CA表达逐渐升高(表2)。进一步分析HLA相关基因信息在各免疫分型中的表达，发现从低免疫组到高免疫组，大部分HLA基因的表达水平逐渐升高，各组间具有统计学差异(图3)。

表1胃癌患者的病例特征

图1胃癌各免疫分型的生存曲线

图2胃癌基于免疫基因组学的分型及ESTIMATE分

图3各免疫分型中HLA的表达水平及组间差异

表2各免疫分型中胃癌相关单基因的表达量(±s)

2.4各免疫分型中肿瘤浸润免疫细胞的组成

通过CIBERSORT分析肿瘤浸润免疫细胞的分布情况，发现有10种浸润免疫细胞在各组间具有统计学差异，从低免疫组到高免疫组，CD8+T细胞逐渐增多，而M0巨噬细胞和幼稚B细胞逐渐减少(图4)。

3、讨论

尽管胃癌在西方国家已不是常见肿瘤，但是在亚洲国家特别是在中国，胃癌发病率在男性中仅次于肺癌和肝癌，在女性中仅次于乳腺癌和肺癌，在癌症相关病死率中高居第3位。晚期胃癌的治疗可选择药物较少且疗效不佳，ICIs的问世改变了传统治疗模式，然而ICIs的疗效在不同的患者间存在明显差异，既往研究发现通过对免疫特征进行评估而制定的免疫分型有助于指导治疗及改善患者的临床预后[11,12]。本研究通过分析TCGA数据库获得的基因表达数据，对胃癌患者进行免疫分型，并进一步分析了各型的免疫特征与预后之间的关系。

图4免疫分型与肿瘤浸润免疫细胞的分布

Kim ST等[13]研究发现PD-1抗体治疗EBV阳性及MSI-H型晚期胃癌的客观缓解率明显高于其他两种分子分型。NCCN指南推荐对拟采用PD-1/PD-L1抗体治疗的胃癌患者，应评估肿瘤组织的EBV感染状态和错配修复缺陷/微卫星高度不稳定状态[14]。1993年Tokunaga等[15]通过原位杂交技术证实胃癌细胞EBV编码的小RNA(EBV-encoded small RNAs,EBERS)阳性者，将之定义为EBV相关性胃癌(EBV-associated gastric carcinoma,EBVa GC)。既往研究发现EBVa GC的发生与PIK3CA、CD274(PD-L1)和PDCD1LG2(PD-L2)的过表达密切相关[16]。本研究发现高免疫组中PIK3CA、PD-L1和PD-L2的表达明显高于其他两组，提示高免疫组中EBVaGC的发生概率偏高，有可能成为PD-1抗体治疗的获益人群。

CDH1是一种与遗传性弥漫性胃癌有关的基因，该基因突变的男性80岁时胃癌的发病率高达70%，而女性发病率高达56%[17]。Her2基因的扩增或过表达与多种肿瘤的不良预后有关，中国胃癌患者Her2阳性率为12%～13%，与患者的年龄、性别、组织学分型及肿瘤部位密切相关，Her2阳性的胃癌患者生存结局较差[18]。本研究发现CDH1及Her2表达在高免疫组中偏低，然而生存分析却发现高免疫组的预后较差，这表明胃癌的预后不能单纯归因于某些基因的改变，并且传统治疗模式对于高免疫组的患者疗效不佳。

既往研究发现TIL数量与患者的预后密切相关，因此TIL是预测抗PD-1抗体疗效重要标志物[19]。本研究发现高免疫组包含的免疫细胞和基质细胞数量最多，并且大部分HLA基因高表达，与其他两组相比具有更强的免疫原性，同时发现高免疫组中CD8+T细胞含量最高，而M0巨噬细胞和幼稚B细胞最少。研究表明，肿瘤相关巨噬细胞能够表达抑制T细胞募集和活化的细胞因子和酶，从而增强对免疫检查点抑制剂的耐药性[20]。而作为消除肿瘤的重要效应T细胞，CD8+T细胞与ICI的疗效密切相关[21]。以上结果进一步证实了高免疫组具有较高的抗肿瘤免疫活性。

综上所述，高免疫组的胃癌患者具有较高的免疫原性及抗肿瘤免疫活性，或许更加适合采用ICIs治疗。基于免疫基因组学的胃癌分型有助于临床医师选择优势治疗人群及进一步制订个体化的免疫治疗方案，然而作为一项探索性的研究，该分型在胃癌中的应用价值仍有待于更多的临床研究验证。

参考文献：

[1]罗远为,梁敏,石波云,等.胃癌相关基因的生物信息学分析及蛋白互作网络构建[J].现代医院,2016,16(10):1418-1422.

王尧,巴宏军,柳子川,周旻,周启明.胃癌免疫基因组学分型及其特征研究[J].现代医院,2020,20(06):891-894.