恶性肿瘤转移是一个多步骤的复杂过程,包括原发肿瘤的发生、局部浸润、外渗和转移灶的形成。越来越多的证据表明,肿瘤细胞与间质微环境之间的相互作用是促成恶性肿瘤转移的重要因素[1,2]。肿瘤细胞可通过自分泌和旁分泌,改变和维持有利于自身生产和发展的局部微环境条件。肿瘤间质微环境亦可通过代谢、分泌、免疫及功能的改变,促进肿瘤细胞的侵袭和转移[3]。研究发现,肿瘤相关巨噬细胞经常在侵袭性前沿处观察到通常与经历上皮-间质转化的癌细胞结合[4]。TAM和EMT转化的肿瘤细胞之间的这种相关性表明这两种细胞群之间有密切的交互作用。

1、肿瘤相关巨噬细胞

肿瘤相关巨噬细胞被证实是存在于肿瘤间质微环境中最为重要的免疫细胞,约为肿瘤间质免疫细胞总数的50%以上[5]。现已认识到,TAM即为M2型巨噬细胞,发挥免疫抑制效应[6]。肿瘤组织通过募集外周血单核细胞或者健康组织中的定居巨噬细胞浸润肿瘤组织,“再教育”其分化为TAM[7]。在1992年,Mantovani等提出了著名的“巨噬细胞平衡假说”。该假说认为,TAM具有既杀伤肿瘤和又促进肿瘤生长的双重作用。随着相关研究的不断深入,已有诸多证据证实,TAM在恶性肿瘤的发生发展、侵袭转移、免疫逃避及其血管和淋巴管生成等过程扮演着十分重要的角色[8,9]。

人们发现在人类和小鼠的多种恶性肿瘤中,如神经胶质瘤、肝癌、黑色素瘤等,TAM浸润的数量和密度与预后不良密切相关[10,11,12]。TAM促进肿瘤发生发展主要表现在分泌VEGF、CXCL8、CCL2等促进肿瘤生长;释放MMPs、uPA、CSF-1、EGF等促进肿瘤浸润与转移;产生IL-10、PGE2、TGF-β等免疫抑制因子,招募调节性T细胞,参与肿瘤的免疫逃避[13,14];表达VEGF、PDGF、FGF等参与肿瘤血管和淋巴管的生成[15]。

2、上皮间质化

上皮-间质化为恶性肿瘤细胞迁移和侵袭的原动力,是肿瘤转移的关键分子事件[16,17]。上皮细胞经过EMT失去细胞极性与基底膜的连接等上皮表型,取而代之为间质表型,并由其获得高度的迁移与侵袭、对抗凋亡和降解胞外基质等能力。因此,阐明EMT的调控有助于我们理解肿瘤的迁移和侵袭。

3、参与TAM与EMT交互作用的关键细胞因子

3.1TGF-β1

转化生长因子-β(TGF-β)作为一种多功能细胞因子,影响细胞分化、增殖、运动和凋亡[18,19]。TGF-β1是TGF-β最重要的成员之一,由两条多肽链组成,分子量约为25kD,广泛存在于正常和癌变的组织内。研究发现许多进展期癌和转移癌患者血清与组织中TGF-β1水平明显升高,提示TGF-β1与恶性肿瘤的侵袭与转移有关[20]。在肿瘤微环境中,TGF-β1是通过浸润免疫细胞如TAM,骨髓来源的抑制细胞和调节性T细胞以及作为EMT主要启动子的细胞产生的[21]。来自TAM的TGF-β1在各种癌症中诱导和促进肿瘤细胞发生EMT,并且它可以自分泌的方式维持正在进行EMT的肿瘤细胞的间充质和干细胞特征[22,23,24,25]。研究表明,M2极化的TAM分泌TGF-β1诱导肝癌、结直肠癌细胞发生EMT,并获得了较高的侵袭能力和肿瘤干细胞样特性[26,27]。耗竭TGF-β1可逆转EMT而阻断了肿瘤干细胞样特性的获得[14]。这些发现证明TAM可能通过与TGF-β1存在的相互作用且在诱导肿瘤EMT中发挥核心作用。

3.2TLR4/IL-10

Toll样受体(TLRs)在先天免疫中起关键作用,主要在巨噬细胞和树突细胞上表达。这些细胞中TLR的激活诱导细胞因子分泌和炎症反应。TLR4已经被证明与炎症介导的癌变和肿瘤发展之间的联系密切相关[28]。TAM中TLR4信号的抑制减少了细胞因子,并减弱了它们在实验性肺转移中的肿瘤促进活性[29]。在肝癌中,有证据表明LPS诱导的EMT需要TLR4/JNK/MAPK信号传导[30,31]。IL-10是一种Ⅱ型细胞因子,已被证明在调控巨噬细胞中发挥重要作用。它由单核细胞,树突状细胞的亚型和活化的巨噬细胞产生[32]。IL-10的局部产生导致肿瘤微环境有利于癌细胞的存活和转移[33,34]。有证据表明,TAM上TLR4信号的激活刺激IL-10的释放增加[35]。最近有研究显示,M2型TAM通过TLR4/IL-10信号传导部分促进了胰腺癌细胞中的EMT发生[36]。

3.3TNF-α

巨噬细胞是TNF-α的主要产生者,对TNF-α具有高度的应答性。高水平的TNF-α可通过激活T细胞介导的免疫来产生抗癌作用,而癌细胞和基质细胞产生的低水平、慢性TNF-α可促进肿瘤的生长和转移[37]。TNF-α可通过抑制E-cadherin、上调波形蛋白表达和激活MMP-9,诱导肾细胞癌发生EMT,促进肿瘤的发生,增加侵袭和迁移能力。最新的一项研究表明,TAM通过分泌TNF-α激活Wnt/β-catenin通路,促进肿瘤细胞发生EMT和获得肿瘤干细胞样特性而促进肝癌的侵袭转移[38]。大量临床证据表明干预TNF-α的有效性,进一步支持TNF-α作为重要的抗癌靶标的作用,靶向TNF-α受体可能促进抗肿瘤的免疫应答。Ji等[39]报道了在体外实验中使用新型TNF-α纳米抗体可抑制其诱导的乳腺癌细胞迁移和侵袭,体内实验表明此纳米抗体与紫杉醇相同剂量化疗联合应用可有效抑制肿瘤的发展、肺转移和EMT。

3.4CCL18

最近研究报道,与未经历EMT的恶性肿瘤相比,EMT转化的乳腺癌细胞具有更好的活化巨噬细胞至M2表型的能力[4]。来自肿瘤细胞的GM-CSF和来自TAM的CCL18形成正反馈回路,以维持共培养系统和人源化小鼠中EMT和M2巨噬细胞的激活状态。中和GM-CSF或CCL18可打破了这一恶性循环,减少了乳腺癌在体外或体内的转移。在子宫内膜癌中研究发现,雌激素受体α阳性的TAM分泌大量的CCL18,通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路上调KIF5B的表达以启动EMT程序[40]。此外,另有多项研究均观察到在头颈部鳞状细胞癌[41]、胆囊癌[42]、肝癌[43]中M2型TAM可通过分泌CCL18驱动EMT以促进肿瘤侵袭转移。

4、参与TAM与EMT交互作用的关键核转录因子

4.1转录因子Snail

转录因子Snail是一种含有锌指结构的DNA结合蛋白,可通过结合E-cadherin启动子的E-box连接基序抑制E-cadherin表达和上调波形蛋白Vimentin表达水平,进而驱动EMT的发生[44]。近期研究表明,Snail驱动的EMT不仅大大增强了肿瘤的侵袭和转移能力,还使其具备诱导免疫抑制的特性[45]。Kudo-saito等[46]基于Snail在肿瘤EMT中的关键作用,将过表达Snail的黑色素瘤细胞与脾细胞共培养,结果观察到Snail阳性的黑色素瘤细胞能够诱导CD4+iTreg生成。Chen等[47]发现Snail可抑制前列腺癌细胞表面HLA-I抗原的表达,促进肿瘤逃逸免疫系统的监视。此外,多项研究显示Snail在肿瘤细胞中可以调节多种细胞因子和趋化因子的表达。在头颈部肿瘤细胞中Snail可激活CCL2、CCL5、IL-6、TNF-α和IL-8的表达;在小鼠乳腺癌细胞系4T1中过表达Snail可引起M2型巨噬细胞的浸润增加并在乳腺癌原位模型中促进侵袭转移[48]。另有研究表明Snail是原发性乳腺肿瘤生长和转移所必须的,其部分通过抑制乳腺癌细胞产生GM-CSF、IL-1α、IL-6和TNF-α来发挥作用,在原发肿瘤部位和肿瘤转移进程中,Snail通过调控GM-CSF表达影响TAM极化,并影响体内乳腺癌转移[49]。以上研究结果表明Snail驱动的EMT在肿瘤免疫微环境中起着转移调节作用。

然而目前Snail介导免疫抑制的发生的分子机理尚不清楚。一项关于EMT介导的TAM激活的机制研究发现[50],Snail直接激活miR21转录以产生高丰度的miR-21外泌体。含有miR21外泌体被人CD14+单核细胞吞噬,抑制M1型标记物的表达而增强M2型的表达。在头颈部肿瘤组织标本中发现miR21的高表达与Snail和M2标志物MRC1的表达呈正相关。此项研究提示miR21高丰度的外泌体可能为拦截EMT介导的TAM重塑提供了潜在的靶标。

4.2转录因子Nrf2

核因子E2相关因子2(NF-E2-relatedfactor2,Nrf2)是CNC碱性亮氨酸拉链转录因子家族的成员,其对于保持氧化应激的平衡非常重要[51]。已有研究表明Nrf2可以直接抑制免疫细胞的炎症细胞因子转录以及通过调节HO-1表达来简介抑制炎症进程[52]。此外,Nrf2已被证明有助于某些肿瘤的进展和化疗、放疗相关抵抗[53,54]。新近研究表明[55],肿瘤细胞可通过激活Nrf2诱导巨噬细胞发生M2型极化。巨噬细胞的Nrf2激活与肿瘤细胞衍生的乳酸诱导的活性氧物质相关。经肿瘤细胞“再教育”的巨噬细胞亦可以使肿瘤细胞中Nrf2活化,使其旁分泌VEGF从而促进肿瘤发生EMT。这些结果表明转录因子Nrf2在肿瘤细胞和巨噬细胞相互作用中起重要作用。

4.3转录因子FoxQ1

叉头盒Q1(FoxQ1)是叉头转录因子家族的成员[56]。研究表明,FoxQ1表达的增加与结肠癌、肺癌和乳腺癌的转移和预后不良有关[57,58,59]。FoxQ1诱导肿瘤细胞发生EMT、获得干细胞样特性和抗化疗诱导凋亡的能力[58]。FoxQ1通过结合E-box的启动子区从而抑制E-cadherin的表达,在乳腺癌细胞中敲除FoxQ1可阻断TGF-β诱导的EMT[60]。在膀胱癌中,研究表明通过shRNA靶向敲除FoxQ1可以逆转EMT来抑制肿瘤细胞的侵袭和转移[61]。在人宫颈癌HeLa细胞中,FoxQ1促进TGF-β1的表达并诱导EMT[62]。在人非小细胞肺癌中,FoxQ1的下调促进上皮标记物的表达,并增加对常规化疗药物的抗性[63]。在肝癌中,FoxQ1表达上调且与瘤内TAM浸润呈正相关,同时其可通过与ZEB2启动子直接结合而激活ZEB2表达诱导EMT,促进肿瘤转移[64]。最新研究表明,TAM通过调节JAK2/STAT3/miR-506-3p/FoxQ1轴来启动EMT,以增强结直肠癌的迁移、侵袭和循环肿瘤细胞介导的转移,并且促进CCL2的分泌,以增加巨噬细胞的募集[65]。综上所述,TAM和FoxQ1信号之间存在相互作用,这可能有助于肿瘤中EMT的发生发展。

4.4转录因子NF-κB

核因子-κB由一系列转录因子组成,它在TAM和肿瘤细胞中起着关键作用,促进肿瘤的发生和发展[66,67]。NF-κB活化是肿瘤细胞获得转移潜能的重要事件,其活化可能是由于TAM和癌细胞之间的“对话”所致。TAM通过分泌TNF-α来促进基质细胞和肿瘤细胞的NF-κB活化,从而上调Snail的表达[68]。TAM还通过激活Gas6/AXL/NF-κB信号通路促进口腔鳞状癌细胞从上皮向间充质表型的转化,并增强肿瘤侵袭和迁移能力[68]。另有研究证明,乳腺癌上皮细胞中NF-κB调控肿瘤生长,增强TAM的募集并促进新生血管生成,使用抑制剂IκBαSR抑制肿瘤干细胞标记物的表达,减少巨噬细胞的浸润并降低肿瘤血管分布和新生血管生成[69]。

5、参与TAM与EMT交互作用的其他因子

新兴证据表明,肿瘤细胞和巨噬细胞之间通过外泌体交换遗传物质或者蛋白质可影响肿瘤免疫微环境和肿瘤发生发展,其中就包括LncRNA和miRNA[70]。Liang等研究报告发现在结直肠癌组织中LncRNARPPH1显著上调,并与晚期TNM分期和预后不良有关。RPPH1通过与β-Ⅲ微管蛋白结合阻止其泛素化,然后诱导结直肠癌细胞发生EMT,同时结直肠癌细胞可通过外泌体将RPPH1转运至巨噬细胞,介导其向M2型极化,从而促进结直肠癌的转移和增殖[71]。另一项研究表明CD68+TAM诱导LncRNAH19原位过表达,可导致EMT发生,促进肝癌细胞干性和侵袭性,并且与肝癌患者预后不良相关[72]。体内外实证实了LncRNAH19的过表达可削弱miR-193b介导的对多种驱动癌基因(EGFR、KRAS、PTEN和IGF1R)和MAPK1的抑制,从而启动了肝癌细胞的EMT和干细胞转化。Takano研究团队发现血清外泌体miR-203是转移性结肠癌患者中肿瘤细胞和单核巨噬细胞“对话”的信号分子[73],当携带miR203的外泌体从结直肠癌细胞转运到巨噬细胞时,可以促进其向M2型TAM分化,而在异种移植的小鼠模型中miR-203高表达的结直肠癌细胞发生了更多的肝转移。此外,Lin等通过体内和体外实验发现miR-195-5p是一种肿瘤抑制因子,它通过直接调节NOTCH2的表达抑制结直肠癌细胞EMT进程,并导致GATA3介导的IL-4的分泌下调,从而阻止巨噬细胞向M2型TAM极化,提示miR-195-5p/NOTCH2-GATA3/IL-4轴可能作为一种潜在治疗靶标[74]。

6、以TAM或EMT为靶标的治疗策略

TAM分泌多种细胞因子和趋化因子,促进相邻上皮肿瘤细胞通过旁分泌方式进行EMT转化。反过来,肿瘤细胞产生的细胞因子也促进TAM的分化过程,从而在肿瘤转移进程中TAM和EMT之间形成正反馈回路促进肿瘤进展、侵袭和转移。因此,打破TAM和EMT之间的“对话”相关通路为靶标治疗侵袭性癌症提供了一个新的方向。

现在以TAM为靶点的研究,大致集中在以下四个方面:①抑制TAM在肿瘤微环境的募集;②抑制TAM的存活;③增加TAM的M1型抗肿瘤活性;④抑制TAM诱导的肿瘤血管生成[75]。TAM具有高度可塑性,可以表现为肿瘤杀伤(M1)或肿瘤促进(M2)[76,77],用抗体、小分子抑制剂、靶向基因敲除或反义RNA抑制CSF-1或其受体抑制CSF-1信号传导,可阻断巨噬细胞的募集,从而抑制癌细胞的增殖和转移[1,78,79,80]。在子宫颈癌和乳腺癌模型中,CSF-1R的抑制导致TAM复极化为由GM-CSF调控的M1表型,具有抗肿瘤免疫应答效应[81]。CSF1R的小分子抑制剂在肿瘤恢复间期,通过耗竭部分TAM,解除其介导的免疫抑制,增强肿瘤的化疗敏感性[82]。另有研究表明低剂量的肿瘤照射可将巨噬细胞转变为活化状态,从而协调T细胞免疫治疗[83]。欧洲批准用于治疗肉瘤和卵巢癌的化疗药物Trabectedin在小鼠模型中发现对TAM具有选择毒性,并抑制肿瘤血管生成[84]。用氯膦酸盐包封脂质体或唑来膦酸对肿瘤微环境中巨噬细胞的特异性消耗可显著抑制结肠癌肝、肺和异种移植模型的肿瘤增殖、血管生成和远处转移[85,86,87]。值得注意的是,近期临床试验中已应用CSF1R的中和抗体治疗过度表达CSF-1的弥漫型巨细胞瘤[85,88]。

EMT是肿瘤转移过程中的关键步骤,miRNA已成为EMT的关键转录后调节因子,因此通过miRNA靶向EMT或EMT相关通路的转录因子已被证明是治疗肿瘤转移的有效策略[89]。例如,miR-200家族成员通过ZEB依赖/非依赖的机制成为EMT和癌症转移的关键抑制因子[90,91]。研究证明将miR-200成员表达于不同的癌症模型(包括肺、卵巢、肾和基底样乳腺癌),导致原发性肿瘤负荷和远处转移的显著减少[92]。科尔特斯等报道称miR-200c瞬时转染的肺癌细胞系A549对辐射的细胞毒性效应有显著的敏感性。肺癌异种移植模型中表达miR-200c增强了放疗的效果[93]。miR34家族通过双负反馈回路的方式下调Snail表达,在降低肿瘤干细胞活力和抑制转移中发挥重要作用[94,95]。Chen等报道B16F10黑色素瘤的实验性肺转移模型中全身性地给予miR-34a导致survivin基因的下调和肺部肿瘤负荷的减少[96]。

鉴于越来越多的证据支持TAM和EMT在肿瘤转移中的存在“对话”,靶向肿瘤转移过程中的信号通路是另一种合理选择。如上所述,TGF-β诱导的信号通路在其中起着重要的作用。因此,TGF-β诱导的信号转导通路是潜在的治疗靶点。例如,CX-4945是蛋白激酶CK2的有效和选择性抑制剂,通过阻断TGF-β1信号通路抑制了A549人肺癌细胞的EMT介导的迁移和侵袭[97]。人参皂苷20(R)-Rg3通过抑制TGF-β1诱导的EMT过程,抑制A549细胞的迁移和侵袭[98]。酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼用于治疗原发性肾癌、晚期原发性肝癌和放射性碘缺乏的晚期甲状腺癌,抑制TGF-β在TAM的释放,降低TGF-β诱导的肿瘤细胞增殖、转移和EMT过程和部分阻断巨噬细胞在体内的活化[99]。此外,最新一项研究提出了一种基于辛伐他汀的双靶点纳米共传递系统,用于调节脂质代谢,作为在癌症治疗中逆转耐药的新策略[100]。该策略一方面作用于肿瘤细胞中下调脂质筏和粘着斑的形成,从而抑制整联蛋白/FAK/ERK信号和EMT;另一方面作用于TAM,通过抑制负责胆固醇稳态和M2极化的LXR/ABCA1信号来促进M2向M1表型转化。这个策略不仅可以逆转肿瘤细胞的EMT,还可以使TAM复极化。TAM的重新编程导致TGF-β的分泌减少,并抑制其驱动的EMT,继而重塑了肿瘤微环境产生联合作用。此外,针对NF-κB通路已成为TAM相关肿瘤转移的研究热点之一。唑来膦酸通过抑制NF-κB信号通路逆转三阴性乳腺癌细胞的EMT[101]。生长抑素衍生物(SMSDX)可以阻断TAM和前列腺癌细胞之间的旁分泌环路,并通过抑制NF-κB的激活来降低迁移和侵袭的风险[102]。

7、结语

越来越多的证据表明肿瘤转移级联反应依赖于EMT修饰的癌细胞和TAM之间的复杂相互作用。尽管EMT、TAM和肿瘤侵袭之间的关系尚未明晰,但累计的实验模型和临床前实验数据支持靶向转录因子和TAM与EMT之间的信号通路可以打破“对话”的环路以对抗转移。随着肿瘤转移机制的进一步阐明,我们相信此类靶向策略将在未来应用于癌症患者的临床。

张帆,郭咸希.肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞与上皮间质化“对话”的研究进展[J].现代肿瘤医学,2020,28(20):3640-3646.