慢传输型便秘是指结肠传输功能障碍所致结肠通过时间延长导致的便秘[1],全球有13%～37%的成年人患有这种常见的慢性难治性胃肠道疾病[2,3],严重影响患者的生活质量,对其治疗的研究十分重要。诸多研究显示,便秘发病机制的研究主要与结肠Cajal间质细胞有关,c-Kit蛋白及其配体干细胞因子(SCF)结合后激活的信号通路可影响其结构变化;同时与体内P物质、血管活性肠肽、生长抑素、一氧化氮、神经肽Y等激素及神经递质含量异常有关[4,5]。

目前临床上主要以促胃肠动力药或各种泻剂治疗便秘,虽在短时间内能缓解,但长期服用会产生药物依赖性,存在惰性结肠、结肠黑便等不良反应[6]。便秘主要是由于脾胃功能失调或大肠传导功能受损,进而导致胃肠道菌群紊乱[7]。豆豉-山楂复合物中豆豉在发酵过程中产生的微生物菌群可调节人体肠道的动态平衡,维持肠道正常功能[8,9],山楂能够消食健脾,行气消滞,辅以蜂蜜,三者结合可增强和胃健脾、润肠通便作用,进而改善便秘。目前关于豆豉-山楂治疗便秘文献报道较少,作用机制尚不明确,故本文基于STC大鼠模型,以结肠组织ICC信号通路为靶点,初步阐明豆豉-山楂复合物治疗便秘的作用机制,为其作为防治便秘保健食品的开发提供科学依据。

1、材料

1.1实验动物

SPF级雄性SD大鼠60只,(200±20)g[哈尔滨医科大学实验动物学部,许可证号:SCXK(黑)2019-001]。大鼠饲养于黑龙江省中医药科学院动物实验中心,自由取食,饮水,每日给予光照12h,室温20～24℃,相对湿度40%～70%,适应性饲养1周。

1.2仪器

酶标仪(TecanInfiniteM200PRO),9600荧光定量PCR仪(杭州博日有限公司);OLYMPUSIX3-SVR显微镜(德国卡尔蔡司公司);AI600凝胶成像系统(美国GE公司)Biofuge®Stratos型全能台式高速低温离心机(上海赛默生物科技发展有限公司);IKA®MS3digital型涡旋振荡器(广州仪科实验室技术有限公司);BP-10型分析天平(德国赛多利斯);鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.3试药

盐酸洛哌丁胺胶囊(西安杨森制药有限公司,批号:H10910085,每片2mg);枸橼酸莫沙必利片(鲁南贝特制药有限公司,批号:H19990317,每片5mg);SP、VIP、SS酶联免疫检测试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号分别为H-218-1-2、H-219-1-2、H-092-1-2);GoTaq®1-StepRT-qPCRSystemA6020试剂盒(Promega生物技术有限公司);SCF、c-Kit、RNACTB引物(上海生工生物工程技术服务有限公司);SCF抗体[SantaCruz生物技术有限公司,批号:SCF(G-3):sc-13126];c-Kit、β-actin抗体(Abcam公司,批号分别为EPR22566-344、TDY041);山羊抗小鼠IgG-HRP二抗[天德悦(北京)生物科技有限公司,批号:S001];TRIzol®Reagent(美国Invitrogen公司,批号:182805)。

豆豉(黑龙江省中医药科学院,自制,批号:20190501)与山楂(北京同仁堂药业)质量比为3∶1,辅以适量蜂蜜(南昌恒巢源生物科技公司),共6g。

2、方法

2.1模型制造

将60只大鼠随机分为空白组、模型组、莫沙必利组和豆豉-山楂复合物高、中、低剂量组,每组10只。除空白组外,其余50只采用洛派丁胺灌胃法[5mg/(kg·d)]复制STC大鼠模型[10]。空白组灌胃给予相同体积蒸馏水,每日一次,连续8d。末次给药后对所有大鼠以10%活性炭混悬液(2mL·kg-1)灌胃,灌胃后开始计时,分笼饲养,记录每只大鼠首粒黑便排出时间。收集造模结束后24h各组大鼠排便粒数进行模型评价[11],进一步确定造模成功后给药。

2.2药物干预

造模成功后,参照文献[12]中人与大鼠用药剂量转换关系,计算各组大鼠的给药剂量。豆豉-山楂复合物高、中、低剂量组分别按6.48、3.24、1.62g/(kg·d),莫沙必利组按1.5mg/(kg·d)的剂量灌胃给予0.075mg·mL-1水的混悬液[13];空白组和模型组给予等体积蒸馏水,每日一次,连续4周。

2.3样本采集

2.3.1血液

实验结束后,经10%水合氯醛腹腔注射麻醉后腹主动脉取血,室温静置30min,在4℃、3000r·min-1条件下离心10min,分离血清,于-80℃冰箱保存备用。

2.3.2结肠

剖腹后,取大鼠结肠组织,生理盐水冲洗内容物,一部分装入10%甲醛固定液中保存,一部分装入冻存管中,于-80℃冰箱保存备用。

2.4观察指标

2.4.1大鼠粪便情况

分别于造模后及治疗第2周、第4周时,收集24h内各组大鼠粪便,记录粒数,并于次日收集各组大鼠每日7h内(早上8:00-下午3:00)粪便,称量粪便湿重,在90℃烘箱中干燥3h,直至在20min内质量不发生变化,即为粪便干重。并按下列公式计算,粪便含水量(%)=(粪便湿重-粪便干重)/粪便湿重×100%。

2.4.2首次排黑便时间及炭末推进率[13]

分别于造模后及治疗2周、4周时,测各组大鼠首次排黑便时间。

末次给药后,各组大鼠禁食不禁水12h,用10%活性炭混悬液对大鼠进行灌胃,每只2mL,30min处死,并立即剖开腹腔,分离肠系膜及其他组织,将上至幽门下至直肠末端的肠管取出,测定自幽门到直肠的长度以及炭墨推进长度。墨汁推进率(%)=墨汁推进长度/肠道全长×100%。

2.4.3结肠组织病理学观察

取各组大鼠结肠组织约1cm,冷生理盐水冲洗,10%多聚甲醛固定,石蜡包埋切片,HE染色,10倍光镜下观察结肠组织形态。

2.4.4ELISA法检测血清中SP、VIP、SS含量

取各组大鼠血清,解冻后稀释成适宜浓度,每孔加样50μL,按照ELISA试剂盒法测定。

2.4.5RT-qPCR法检测SCF、c-KitmRNA表达量[14]

取结肠组织按试剂盒方法提取RNA。反应体系为20μL,扩增条件为95℃预处理10min,(95℃变性10s,60℃退火30s,72℃延伸30s)×40个循环。内参基因及引物序列见表1。采用相对定量法分析待测基因mRNA的相对表达量,相对表达量=2-△△t。各检测指标基因序列见表1。

表1内参基因及引物基因序列

2.4.6Westernblot

检测结肠组织SCF、c-Kit蛋白表达量,按照说明书提供的SCF、c-Kit蛋白分子量,选择合适浓度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳;电泳后将凝胶剥离进行转膜(NC膜,200mA,90min);然后用5%脱脂牛奶摇床封闭30min,添加一抗4℃卵育过夜;洗膜;二抗摇床卵育2h;洗膜,显影拍照;以β-actin为内参(抗体浓度均按说明书提供比例稀释)。

2.5统计学方法

以SPSS20.0统计软件进行数据处理分析,结果以均数±标准差(x¯±s)表示,多组样本采用One-WayANOVA分析,两组样本采用t检验分析,P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1豆豉-山楂复合物对STC大鼠粪便质量的影响

与空白组相比,模型组大鼠24h内排便粒数明显减少(P<0.01),经豆豉-山楂复合物治疗后,各给药组大鼠排便粒数均提升,其中高、中剂量组增加明显(P<0.01),结果见表2。

表2各组大鼠24h排便粒数及7h粪便湿重、干重及含水量(x¯±s,n=10)

与空白组相比,模型组大鼠在7h内粪便质量和水分均明显减少(P<0.01,P<0.05),给药治疗4周后,与模型组相比,复合物高剂量组大鼠粪便湿重、干重有明显的上升趋势(P<0.01,P<0.05);复合物各剂量组大鼠粪便水分均显著增加(P<0.01)。

3.2豆豉-山楂复合物对STC大鼠肠道推进功能的影响

如图1所示,与空白组相比,模型组大鼠首次排黑便时间明显延长(P<0.01),小肠炭末推进率显著降低(P<0.01)。给药治疗4周后,与模型组相比,复合物各剂量组大鼠排黑便时间都明显缩短(P<0.05,P<0.01),并呈剂量依赖性;小肠炭末推进率均显著升高(P<0.01,P<0.05)。

图1各组大鼠首次排黑便时间（A）及炭未推进率（B)

3.3豆豉-山楂复合物对STC大鼠结肠组织形态学的影响

各组大鼠结肠组织病理形态学观察如图2所示。空白组大鼠结肠黏膜组织层较厚,黏膜层上细胞饱满,黏膜上皮完整,绒毛丰富,排列整齐,隐窝上皮细胞分离度良好,具有少量杯状细胞(见图2K);与空白组相比,模型组大鼠结肠黏膜组织层明显变薄,黏膜层上细胞干瘪,细长,肠绒毛变短且断裂,局部黏膜下层疏松呈积液状,见血管扩张,充血,炎症细胞浸润,杯状细胞明显增多(见图2M);给药治疗4周后,上述黏膜层组织及细胞形态均有所缓解(见图2Y～2Z)。各组大鼠结肠黏膜组织层均有一定程度的增厚,黏膜上皮细胞变得圆润,隐窝上皮细胞分离度改善,杯状细胞有所减少,偶见炎症细胞浸润。复合物低剂量组大鼠结肠组织隐窝缩短,绒毛变短,杯状细胞较多,黏膜下层偶见充血水肿(见图2D)。

图2各组大鼠结肠组织切片（→表示结肠黏膜组织层；HE，×10)

3.4豆豉-山楂复合物对STC大鼠血清中SP、VIP、SS的影响

与空白组相比,模型组大鼠血清中SP含量明显降低,VIP、SS含量明显升高;给药治疗4周后,与模型组相比,莫沙必利组、复合物高、中剂量组SP含量明显升高,VIP、SS含量显著降低,结果见表3。

3.5豆豉-山楂复合物对STC大鼠结肠组织SCF、c-KitmRNA表达的影响

与空白组比较,模型组大鼠结肠组织SCF、c-KitmRNA表达显著降低(P<0.01),给药治疗4周后,与模型组相比,莫沙必利组和复合物高、中剂量组大鼠结肠组织SCF、c-KitmRNA表达显著增加(P<0.01),并呈剂量依赖性;其中复合物低剂量组大鼠结肠组织SCFmRNA表达增加不明显,c-KitmRNA表达明显增加(P<0.05),见表3。

3.6豆豉-山楂复合物对STC大鼠结肠组织SCF、c-Kit蛋白表达的影响

如图3所示,比空白组相比,模型组SCF、c-Kit蛋白条带颜色明显变浅,说明造模后大鼠结肠组织中SCF、c-Kit两种蛋白表达含量显著减少(P<0.01)。给药治疗4周后,与模型组相比,莫沙必利组和复合物各剂量组大鼠结肠组织SCF、c-Kit蛋白表达量均有不同程度的增加(P<0.01)。

图3各组大鼠结肠组织中SCF和c-Kit蛋白表达

表3各组大鼠血清中SP、VIP、SS含量及结肠组织SCF、c-KitmRNA的表达含量

4、讨论

目前,国内外相关的STC模型建立方法中药物造模法居多[15,16]。常见药物有吗啡、硫糖铝、洛哌丁胺、复方地芬诺酯等。其中吗啡、复方地芬诺酯具有中枢神经抑制作用,属于控制药品不易得;硫糖铝延长大鼠排便时间比洛哌丁胺短[17],模型不稳定;洛哌丁胺作用于肠壁阿片受体,能阻止乙酰胆碱和前列腺素的释放而抑制肠道平滑肌的收缩,减少肠蠕动,使肠内容物通过延迟[18,19],且模型稳定。故本实验选择洛哌丁胺造模。

ICC细胞是肠道内的慢波起搏细胞,也是肠神经递质作用的靶细胞,参与调控了肠神经信号的传递过程,是肠神经与平滑肌信号传导的中介[20,21]。ICC的特异性标志物c-Kit蛋白及SCF结合后激活的细胞内信号转导通路是Cajal表型发生变化的重要原因[22]。所以,c-Kit和SCF基因的表达是维持这一信号通路的必要条件,当两者基因表达受到药物或疾病影响时,c-Kit/SCF信号通路必定受影响而导致ICC表型不能维持和丧失生理功能使机体出现胃肠功能的紊乱[23]。

ICC作为肠神经系统调控平滑肌细胞运动中介,可通过调节神经递质的分泌来调节胃肠道功能[24,25,26]。SP是主要的胃肠激素,能够直接加快结肠的收缩运动和刺激消化道平滑肌的收缩[27];VIP能够抑制肠道松弛、抑制结肠和直肠的紧张性,直接影响便秘的产生[28];SS作为肠神经系统的抑制性神经递质,可以调节肠肽类激素的分泌释放及抑制胃肠蠕动[29,30]。通过本实验研究发现,给予豆豉-山楂复合物治疗4周后,STC大鼠便秘现象有明显改善,结肠组织病理形态有所恢复,同时发现该复合物能明显提高血液中SP含量,降低VIP、SS含量,增加大鼠结肠组织SCF、c-KitmRNA及蛋白表达,使得ICC细胞维持正常表型,进而调节大鼠胃肠道功能,促进肠道蠕动,改善便秘,作用机制见图4。

图4豆豉-山楂复合物治疗STC作用机制

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基金:国家现代农业中药材产业技术体系建设专项资金资助(No.CARS-21);2017年哈尔滨市应用技术研究与开发项目(No.2017RAGYJ009).