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Y1细胞生物学特性及其在肾上腺皮质功能研究中的应用价值分析

2020-08-11 193 上传者：管理员

摘要：肾上腺皮质功能减退、肾上腺糖皮质激素分泌减少是肾虚证发生的主要物质基础,因此肾上腺皮质细胞在探索肾虚及补肾机制研究方面具有重要价值。Y1小鼠肾上腺皮质瘤细胞(Y1细胞)已广泛用于肾上腺皮质功能的体外研究。综述Y1细胞的来源、不同细胞系的衍变、类固醇激素的合成途径以及Y1细胞增殖与功能相关的信号通路,以期为肾虚证发病机制、补肾中药的有效成分筛选及作用机制研究提供参考。

关键词：
Y1细胞
中药
类固醇激素
肾上腺皮质
补肾
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在众多慢性病、难治病中,肾虚证是常见证候之一。临床糖皮质激素治疗过程中及停药后,也时常出现肾虚或肾虚相火旺等证候。因此,补肾是中医临床的常用治法。研究表明,肾上腺皮质功能减退、肾上腺糖皮质激素分泌减少是肾虚证发生的主要物质基础[1]。肾上腺糖皮质激素可调节生理功能和内环境稳态,参与炎症反应和免疫反应[2]。许多疾病的发生、发展、治疗和预后中均表现出肾上腺糖皮质激素分泌异常,且直接影响疾病进程和药物疗效,因此阐明其分泌机制及影响因素具有重要意义。

体内的糖皮质激素主要来源于肾上腺。肾上腺分为髓质与皮质。肾上腺髓质的嗜铬细胞可分成肾上腺素能细胞和去甲肾上腺素能细胞[3],分泌大约80%的肾上腺素和20%的去甲肾上腺素。肾上腺皮质分为三个区域,即球状带、束状带和网状带[4]。皮质类固醇是由肾上腺皮质产生的类固醇激素,包括盐皮质激素、糖皮质激素和雄激素。球状带分泌盐皮质激素,如醛固酮,其分泌受肾素-血管紧张素-醛固酮系统中血管紧张素Ⅱ介导,亦由血钾浓度和促肾上腺皮质激素调节[5]。束状带约占皮质体积的78%,产生糖皮质激素,其水平受下丘脑-垂体-肾上腺轴的调节。人体内主要的糖皮质激素是皮质醇,某些物种(如啮齿类动物)不产生皮质醇,其生物学功能由皮质酮替代。网状带分泌雄激素,主要包括去氢异雄酮、雄烯二酮等,ACTH[6]和促肾上腺皮质激素释放激素[7]也可调节网状带雄激素的分泌。在小鼠和大鼠的肾上腺中,由于缺乏17α-羟化酶,故不能合成肾上腺雄激素[8]。

肾上腺皮质原代细胞在培养过程中寿命有限,难以满足实验需求,且培养时易受成纤维细胞污染,原代细胞对ACTH的应答能力及皮质醇的生成能力还可能随细胞传代而发生变化。基于这些原因,肾上腺皮质体外细胞模型多采用永生化细胞系。目前Y1小鼠肾上腺皮质瘤细胞(Y1细胞)已广泛用于肾上腺皮质功能的体外研究。本文就Y1细胞来源和衍变、Y1细胞中类固醇激素的合成途径以及Y1细胞增殖与功能相关的信号通路进行综述。

1、Y1细胞来源和衍变

1.1Y1细胞来源

Y1细胞来源于暴露在原子弹辐射后的LAF1(C57L×A/HeJ)成年雄性小鼠,从其体内的肾上腺皮质肿瘤中分离获得[9,10],但肿瘤的产生是否由辐射诱导或是自发形成则不确定[11]。将肿瘤离体培养,可分泌Δ4-3-酮类固醇,其中皮质酮分泌量为每2h100mg。肿瘤切片在含有ACTH的环境下孵育后,类固醇分泌量增加约6倍。

将肿瘤进行移植,第3代移植瘤对低水平ACTH敏感,皮质酮的合成随着ACTH浓度的增加而增加;在第7代移植体,部分肿瘤对低剂量ACTH的刺激无应答;随着连续的移植,肿瘤对ACTH的敏感性降低甚至丧失,且21-羟基化显著抑制,但11β-羟基化无明显变化;将第7代移植瘤进一步传代(第8代至第11代),均未检测到皮质酮[12]。Buonassisi等[13]继续培养这种产生激素的肿瘤细胞,发现皮质酮无分泌,C21位无羟基化,肿瘤细胞经连续传代,生长能力增加。另外,该肿瘤细胞能够在没有ACTH刺激的情况下将孕烯醇酮转化为Δ4-3-酮类固醇[14]。

与以上结果不同的是,Humphreys等[15]发现这种辐射后产生的可移植肾上腺肿瘤虽然保留其大部分原始特征,包括产生肾上腺类固醇激素和引起宿主肾上腺萎缩的能力,但已对其起源的LAF1小鼠具有抗原性,且不再出现转移,机体免疫也影响这些肿瘤的生长速度。

Yasumura等[16]将这种肾上腺肿瘤进行体外培养,新鲜肿瘤培养物几乎完全由上皮细胞组成,成纤维细胞随传代过程而增多。借助单细胞培养技术从这些混合培养物中获取克隆,其在功能特性上与肾上腺皮质广泛相似,并且可以在连续培养过程中保持这些特征超过1年。该克隆为亚二倍体,具有39个染色体,其在ACTH刺激后能分泌类固醇激素。在高浓度血清培养基(15%马血清+2.5%胎牛血清)中生长时,该克隆能较好地发挥生物学功能,但转移到低浓度血清培养基(2.5%马血清)后则失去了分泌类固醇激素的能力,再次移回高浓度血清培养基时又可恢复这种能力。美国模式培养物集存库(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)销售的Y1细胞系(CCL-79)即来自该上皮克隆细胞系,含有39个染色体,具有末端着丝粒和双微体,可分泌类固醇激素。

Y1细胞对单纯疱疹病毒、伪狂犬病毒、痘苗病毒、水疱性口炎病毒和人类脊髓灰质炎病毒具有易感性。Y1细胞适应F-12K培养基、15%马血清、2.5%胎牛血清的条件,培养环境为37℃、5%CO2,Y1细胞呈扁平状贴壁生长。

1.2Y1细胞衍变

Y1细胞在连续培养时由于克隆变体的积累,表现出类固醇生成能力的差异,并且类固醇的分泌量最终下降。为减少这种与细胞相关的变异性,一些Y1细胞亚克隆被分离[11]。Schimmer等[17]分离出4种克隆的肾上腺肿瘤细胞系:Y6、OS3、OS1和OS4,这4种细胞系在ACTH刺激的类固醇生成途径中具有生化损伤的表型变异,不再响应ACTH刺激产生类固醇。Y6和OS3虽无ACTH应答反应,但可以通过环磷酸腺苷刺激产生类固醇[18]。

Rae等[19]认为,Y6和OS3细胞的缺陷部位在ACTH受体主要结合区与腺苷酸环化酶系统催化亚基连接的区域,但两者的损伤位点不同。OS1和OS4在cAMP激活的类固醇生成途径中具有表型损伤,可用于类固醇生成的相关研究,但不能用于cAMP激活的研究。

Rae等[20]从Y1细胞中分离出两组突变克隆Y1(Kin)和Y1(Cyc)。Y1(Kin)细胞溶质的环磷酸腺苷依赖蛋白激酶活性大大降低;而Y1(Cyc)表型类似于Y6和OS3,在其突变体中,ACTH对类固醇生成几乎没有影响,而cAMP是活跃的。

Y1-BS1是从Y1细胞系分离的稳定亚克隆,对ACTH刺激敏感。在Y1-BS1细胞制备的匀浆中,ACTH刺激的腺苷酸环化酶活性较基础水平提升16倍,且具有大量的p68,而在缺乏ACTH应答反应的克隆细胞中p68含量低下[21,22]。

Schimmer等[23]使用毛喉素作为选择剂,从Y1细胞系中分离出毛喉素抗性克隆Forsk-lor-1、Forsk-lor-6和Forsk-lor-9,这些克隆中的突变可能是腺苷酸环化酶系统的一个组成部分,影响激素的作用。

以上Y1细胞系的亚克隆中,Y1-BS1的应用最多,其不仅能够响应ACTH刺激,且在类固醇生成中具有较强的稳定性。

2、Y1细胞中类固醇激素的合成途径

正常人体内肾上腺皮质细胞的类固醇激素合成途径如图1所示。细胞色素P450(cytochromeP450,CYP)和羟类固醇脱氢酶等在类固醇激素生成途径中发挥重要作用[24]。人类基因组中涉及57种CYP基因,催化多种氧化反应,其中类固醇生成过程涉及6种。HSD可分为脱氢酶和还原酶,脱氢酶将羟基类固醇氧化为酮类固醇,还原酶将酮类固醇还原为羟基类固醇。胆固醇转化为孕烯醇酮是线粒体中类固醇激素生物合成的第一个重要环节,而后在多种酶作用下生成类固醇激素。

图1正常人体肾上腺皮质细胞的类固醇合成途径

正常小鼠肾上腺皮质可产生皮质酮(11β,21-二羟基孕烯-3,20-二酮),以替代人体内皮质醇的生理功能,且激素生成途径中的CYP21A2酶由小鼠体内CYP21A1酶替代并发挥作用。

正常小鼠肾上腺皮质产生皮质酮作为主要类固醇产物,但Y1细胞有所不同,该细胞产生20α-羟基-4-孕烯-3,11-二酮。Pierson[25]采用紫外和红外光谱技术,从小鼠肾上腺皮质肿瘤的培养基中鉴定其分泌的类固醇激素,包括孕酮、11β-羟基孕酮、20α-羟基-4-孕烯-3,11-二酮、20α-羟基-4-孕烯-3-酮和11β,20α-二羟基-4-孕烯-3-酮,并归纳小鼠肾上腺皮质肿瘤培养过程中类固醇激素的合成途径,即胆固醇经一系列转化最终形成20α-羟基-4-孕烯-3,11-二酮。见图2。

图2Y1细胞的类固醇合成途径

Kowal等[26]研究证实,Y1细胞可产生20α-羟基-4-孕烯-3-酮和11β,20α-二羟基-4-孕烯-3-酮,而小鼠肾上腺产生的主要类固醇为皮质酮,产生差异的原因主要在于早期肿瘤移植过程中C21位无羟基化,即Y1细胞缺乏CYP21。

Parker等[27]通过与PSV2-neo共转染,将含有21-OHasea或b(羟化酶)基因的质粒导入Y1细胞,部分相关克隆恢复了其转化为皮质酮的能力。

此外,用于类固醇合成的胆固醇起源较复杂,多数胆固醇来自摄取的含胆固醇酯的脂蛋白。胆固醇转化为类固醇激素的最初部分涉及CYP家族的众多酶,它们位于线粒体的内膜中。Y1细胞系能够从葡萄糖或乙酸盐合成胆固醇,进而进行类固醇的生成。

3、Y1细胞增殖与功能相关的信号通路

3.1ACTH/cAMP信号通路

ACTH可维持肾上腺皮质细胞的正常形态和生理功能,ACTH缺乏则细胞分泌功能减退。细胞外信号(如ACTH)与相应受体结合后改变细胞内cAMP水平,进而激活cAMP-PKA信号通路,调节细胞功能。ACTH对Y1细胞的作用依赖于ACTH敏感的腺苷酸环化酶系统[28],而cAMP是ACTH诱导的类固醇生成的必需成分[29]。丝切蛋白作为cAMP介质,影响肾上腺皮质肿瘤细胞形态功能,并在类固醇生成中发挥作用[30]。

3.2SonicHedgehog(SHH)信号通路

SHH信号通路涉及胚胎发育、器官形成。该信号通路主要由靶细胞膜上的跨膜蛋白Ptc和Smo介导,Ptc对Hedgehog信号起负反馈调节作用。SHH信号通路的调控维持胎儿和成人肾上腺皮质的形态。SHH信号丧失后,小鼠肾上腺体积减少50%～70%,且肾上腺皮质细胞发生形态学改变[31]。

3.3Wnt/β-catenin信号通路

Wnt/β-catenin信号通路在维持胎儿和成人肾上腺皮质功能方面起重要作用,其过度活化会导致祖细胞样细胞和肿瘤形成的增加。在肾上腺皮质肿瘤中,Wnt/β-catenin通路异常激活。在Y1细胞,其中心体内的DNA依赖性蛋白激酶异常激活,类固醇生成因子-1(steroidogenicfactor-1,SF1)被消耗,导致中心粒分裂和扩增。中心体DNA-PK信号传导引发β-连环蛋白的积累,中心体过度复制、中心粒分裂,进而导致基因组的不稳定性和细胞数量的减少[32]。

3.4p38MAPK信号通路

p38MAPK信号通路参与细胞应激反应和细胞因子调节,亦与肿瘤细胞的细胞周期和凋亡相关。研究发现,H2O2处理Y1-BS1细胞可增强p38MAPK和cAMP反应元件结合蛋白的磷酸化,而磷酸化作用可被p38MAPK抑制剂SB203580消除,p38MAPK介导的反馈抑制途径通过降低CREB转录活性干扰类固醇生成[33]。另外,环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)参与脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的Y1细胞类固醇的产生,LPS通过激活p38MAPK和磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(serine/threoninekinase,AKT)信号通路诱导COX-2表达,促进类固醇合成[34]。

3.5其他基因蛋白

Y1细胞中还有一些基因和蛋白表达的变化可导致细胞功能的改变。研究表明,在Y1细胞中敲除突触融合蛋白5(syntaxin5,STX5)或可溶性NSF附着蛋白α,将减少类固醇生成[35]。Jun二聚化蛋白2(Jundimerizationprotein2,JDP2)参与黑素皮质素2受体(melanocortin2receptor,MC2R)介导的类固醇生成,亦作为肾上腺皮质细胞传导信号。Y1细胞中JDP2的过表达可上调MC2R蛋白的水平[36]。邻苯二甲酸单丁酯通过作用Y1细胞miRNA-200c,上调波形蛋白,促进类固醇激素的合成[37]。当Y1细胞暴露于MBP时,波形蛋白启动子中的DNA去甲基化,进而调节黄体酮的分泌[38]。此外,ACTH可增加Y1细胞中含脯氨酸-谷氨酸-丝氨酸-苏氨酸结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶的表达[39]。

4、小结与展望

目前,Y1细胞已广泛应用于肾上腺皮质功能的体外研究,如类固醇分泌。采用Y1细胞及其衍生的突变体细胞作为内分泌研究的细胞模型,具有稳定性强、条件易控制、可无限增殖等优点,且Y1细胞的一些亚克隆还能够响应ACTH刺激。

鉴于该细胞的来源和生物学特性及已证实的肾虚证与肾上腺糖皮质激素分泌减少相关[1],Y1细胞可用来阐释肾虚证的发病机制,并用以筛选补肾中药及其有效成分、探析补肾中药的作用机制。中药可通过激活Y1细胞促进皮质酮的合成与分泌。潘志强等[40]研究发现,补肾中药组分蛇床子素可上调Y1细胞StAR、Cyp11a1、Cyp21a1、Hsd3b2、Cyp11b1、Cyp17a1及Hsd17b3的基因表达,促进皮质酮分泌水平升高,提示蛇床子素可能通过增强类固醇激素合成相关酶的基因表达,参与调节肾上腺皮质功能,并以促进皮质酮的合成与分泌为主。梁龙龙等[41]研究发现,在一些受试的补肾中药组分中,补骨脂素能够显著促进Y1细胞Cyp11b1基因表达,而淫羊藿苷、松果菊苷、仙茅苷、金丝桃苷、松脂醇二葡萄糖苷、耐斯糖等的作用并不明显。这些研究可视为Y1细胞应用于中医药研究的有益尝试,或为中医基础理论有关的“肾”本质、“肾虚证”、“补肾”治法以及补肾中药有效成分的筛选和机制研究提供参考。

参考文献：

[1]沈自尹.从肾本质研究到证本质研究的思考与实践——中西医结合研究推动了更高层次的中医与西医互补[J].上海中医药杂志,2000,34(4):4-7.

[40]潘志强,梁龙龙,方肇勤,等.蛇床子素对Y1小鼠肾上腺皮质瘤细胞皮质功能的影响[J].中国中西医结合杂志,2016,36(5):574-579.

[41]梁龙龙,潘志强,方肇勤,等.不同温补肾阳中药主要组分对小鼠肾上腺皮质瘤细胞增殖及皮质酮分泌的影响[J].上海中医药大学学报,2016,30(2):72-77.

费敏红,潘志强,方肇勤.Y1细胞生物学特性及其在肾上腺皮质功能研究中的应用[J].上海中医药大学学报,2020,34(04):103-108.