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巨噬细胞极化对血管平滑肌细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响

2025-03-17 112 上传者：管理员

摘要：目的：探讨巨噬细胞极化对血管平滑肌细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路和炎症反应的影响。方法：佛波酯诱导THP-1细胞成为巨噬细胞，分别用LPS和IFN-γ、IL-4和IL-13处理48 h，更换不含血清的新鲜培养基培养24 h，取上清作为条件培养基。将血管平滑肌细胞分成对照组、M0培养基组、M1培养基组和M2培养基组。CCK-8检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡，ELISA检测细胞上清中炎症因子IL-1α、IL-6和TGF-β表达，RT-qPCR和Western blot检测血管平滑肌细胞中PI3K、Akt、mTOR mRNA和磷酸化蛋白表达。结果：与对照组相比，M0培养基组细胞增殖能力、细胞上清中TGF-β水平显著降低（P<0.01），细胞凋亡率、细胞上清中IL-1α和IL-6水平、细胞中PI3K、Akt、mTOR mRNA和蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.01）；与M0培养基组相比，M1培养基组细胞增殖能力、细胞上清中TGF-β水平显著降低（P<0.05），细胞凋亡率、细胞上清中IL-1α和IL-6水平、细胞中PI3K、Akt、mTOR mRNA和蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.01）,M2培养基组趋势相反（P<0.05）。结论：巨噬细胞极化能够通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路调节炎症细胞因子表达，参与动脉粥样硬化炎症反应。

关键词：
PI3K/AKT/mTOR信号通路
冠状动脉疾病
动脉粥样硬化
巨噬细胞极化
脑血管疾病
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动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种危害人体健康的慢性疾病，可恶化为包括脑血管疾病和冠状动脉疾病在内的循环系统疾病［1］。AS的发病机制复杂，研究表明，炎症在AS的所有阶段均发挥重要作用，因此研究如何有效抑制炎症对AS治疗具有重要意义［2］。血管平滑肌细胞和巨噬细胞等多种细胞在AS发展中发挥关键作用。研究表明，促进血管平滑肌细胞增殖和迁移能够促进AS形成［3］。而巨噬细胞对AS的影响主要体现在巨噬细胞极化和不同表型在AS斑块中的比例［4］。巨噬细胞主要分化为M1型和M2型，M1型表达高水平的CD86，能够释放炎症因子，而M2型表达高水平的CD206，能够释放抗炎因子。研究表明，促进巨噬细胞向M2型极化能够延缓AS进展［5］，但机制仍不清楚。PI3K/Akt/mTOR通路参与调节细胞代谢、凋亡和炎症等过程，对细胞稳态至关重要［6］。研究表明，PI3K/Akt/mTOR通路参与巨噬细胞极化和AS进程调节［7］。但巨噬细胞极化对血管平滑肌细胞炎症反应和PI3K/Akt/mTOR通路的影响仍不清楚，因此本研究通过构建巨噬细胞条件培养基，明确巨噬细胞极化对血管平滑肌细胞PI3K/Akt/mTOR通路和炎症反应的影响，为AS治疗提供依据。

1、材料与方法

1. 1　材料　

血管平滑肌细胞和巨噬细胞THP-1购自上海赛百慷生物技术股份有限公司；iCell原代平滑肌细胞培养体系、RPMI1640完全培养基购自上海赛百慷生物技术股份有限公司；F4/80（FITC）购自英国Abcam公司；IFN-γ、IL-4、IL-13购自美国pepro‐tech公司；流式抗体CD86和CD206购自美国eBio‐science公司；LPS、佛波酯（PMA）购自美国Sigma公司；CCK8、RIPA裂解液、十二烷基硫酸钠、蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京Solarbio公司；凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；人IL-1α、IL-6、TGF-βELISA试剂盒、兔抗PI3K、Akt、mTOR、p-PI3K、pAkt、p-mTOR、GAPDH和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗购自武汉Bioswamp公司；PVDF转移膜购自美国Millipore公司。

1. 2　方法　

1. 2. 1　细胞培养　

血管平滑肌细胞和THP-1细胞分别用iCell原代平滑肌细胞培养体系和含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基置于37℃、5%CO2培养，细胞融合度达到80%以上时胰酶消化，并按照1∶2传代培养。

1. 2. 2　条件培养基制备　M0型条件培养基：

将对数生长期THP-1细胞接种至培养板，PMA 50 ng/ml处理24 h诱导为M0型巨噬细胞；M1型条件培养基：THP-1细胞经PMA诱导为巨噬细胞后，LPS 100 ng/ml和IFN-γ20 ng/ml诱导48 h成为M1型巨噬细胞［8］；M2型条件培养基：THP-1细胞经PMA诱导成巨噬细胞后，IL-4 20 ng/ml和IL-13 20 ng/ml诱导48 h成为M2型巨噬细胞［9］。诱导完成后用不含血清的新鲜培养基继续培养24 h，取上清作为条件培养基。

1. 2. 3　流式细胞术检测M1和M2型巨噬细胞百分率　

取各条件培养基中处于对数生长期的细胞，PBS重悬后按照流式抗体说明书用量，检测M1型巨噬细胞时加入2 µl F4/80抗体和2 µl CD86抗体，检测M2型巨噬细胞时先加入2 µl F4/80抗体，再加入固定剂和破膜剂，最后加入2 µl CD206抗体，4℃避光孵育30 min，流式细胞仪检测M1和M2型巨噬细胞比例。

1. 2. 4　细胞分组及处理　

将血管平滑肌细胞分为对照组、M0培养基组、M1培养基组和M2培养基组，各组细胞分别用正常培养基、M0型条件培养基、M1型条件培养基和M2型条件培养基培养。

1. 2. 5 CCK-8检测细胞增殖能力　

调整细胞悬液浓度，接种于96孔板，过夜培养使细胞贴壁，各组用不同培养基处理完成后，继续培养48 h，加入CCK-8溶液，培养4 h后检测450 nm处吸光度。

1. 2. 6　流式细胞术检测细胞凋亡　

收集各组对数生长期细胞，预冷PBS洗涤，加入10 µl AnnexinⅤ-FITC和10 µl PI，4℃避光孵育30 min，加入PBS后流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1. 2. 7 ELISA检测

细胞上清中炎症因子IL-1α、IL-6、TGF-β　收集细胞上清，严格按照试剂盒说明书步骤检测细胞上清中炎症因子IL-1α、IL-6、TGF-β水平。

1. 2. 8 RT-qPCR检测血管平滑肌细胞中PI3K、Akt、mTOR mRNA表达　

提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，进行PCR扩增，扩增完成后，以GAPDH为内参，2−ΔΔCt法计算目的基因PI3K、Akt、mTORmRNA表达。

1. 2. 9 Western blot检测血管平滑肌细胞中PI3K、Akt、mTOR蛋白表达　

RIPA裂解液裂解各组细胞，提取总蛋白并进行蛋白定量，SDS-PAGE电泳后湿转至PVDF膜，封闭，洗膜后加一抗，4℃孵育过夜，加二抗室温孵育1 h，洗膜，曝光，Image J软件分析条带灰度值。

1. 3　统计学分析　

用GraphPad Prism 8. 0软件进行统计学分析，结果用xˉ±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P<0. 05为差异有统计学意义。

2、结果

2. 1 M1和M2型巨噬细胞鉴定　

与M0培养基组相比，M1组CD86表达升高（P<0. 01），M2组CD206表达升高（P<0. 01，图1），表明M1和M2巨噬细胞诱导成功，即各条件培养基制备成功。

2. 2　不同条件培养基对血管平滑肌细胞增殖的影响　

与对照组相比，M0培养基组细胞增殖能力显著降低（P<0. 01）；与M0培养基组相比，M1培养基组细胞增殖能力显著降低（P<0. 01），而M2培养基组细胞增殖能力显著升高（P<0. 01，图2）。

2. 3　不同条件培养基对血管平滑肌细胞凋亡的影响　

与对照组相比，M0培养基组细胞凋亡率显著升高（P<0. 01）；与M0培养基组相比，M1培养基组细胞凋亡率显著升高（P<0. 01），而M2培养基组细胞凋亡率显著降低（P<0. 01，图3）。

2. 4　不同条件培养基对血管平滑肌细胞上清中炎症因子水平的影响　

与对照组相比，M0培养基组细胞上清中IL-1α 和IL-6水平显著升高（P<0. 01），TGF-β 水平显著降低（P<0. 01）；与M0培养基组相比，M1培养基组细胞上清中IL-1α 和IL-6水平显著升高（P<0. 01），TGF-β 水平显著降低（P<0. 05），而M2培养基组细胞上清中IL-1α 和IL-6水平显著降低（P<0. 01），TGF-β水平显著升高（P<0. 05，图4）。

2. 5　不同条件培养基对血管平滑肌细胞中PI3K、Akt、mTOR mRNA表达的影响　

与对照组相比，M0培养基组细胞中PI3K、Akt、mTOR mRNA表达显著升高（P<0. 01）；与M0培养基组相比，M1培养基组细胞中PI3K、Akt、mTOR mRNA表达显著升高（P<0. 01），而M2培养基组细胞中PI3K、Akt、mTORmRNA表达显著降低（P<0. 05，图5）。

2. 6　不同条件培养基对血管平滑肌细胞PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平的影响　

与对照组相比，M0培养基组细胞PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平显著升高（P<0. 01）；与M0培养基组相比，M1培养基组细胞PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平显著升高（P<0. 01），而M2培养基组细胞PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平显著降低（P<0. 01，图6）。

图1 M1型（A）和M2型（B）巨噬细胞诱导结果鉴定

图2　各组细胞增殖能力比较

图3　各组细胞凋亡率比较

图4　各组细胞上清中IL-1α、IL-6和TGF-β水平比较

图5　各组细胞中PI3K、Akt、mTOR mRNA表达比较

图6　各组细胞中PI3K、Akt、mTOR蛋白表达比较

3、讨论

炎症被认为是AS发病机制中较为经典的机制之一，巨噬细胞作为炎症细胞在AS炎症反应中发挥重要作用［10］。研究表明，巨噬细胞浸润病变并参与AS斑块进展，这一过程中，不同类型巨噬细胞极化在AS炎症中发挥重要作用。巨噬细胞参与AS整个发展过程，巨噬细胞数量、表型和迁移与AS斑块的命运密切相关［11］。巨噬细胞在AS整个过程中表现出高度异质性，可经斑块内微环境刺激后呈现不同极化亚型，极化亚型能够影响斑块大小和稳定性［12］。根据巨噬细胞极化亚型特征可分为促炎型（M1）和抗炎型（M2），其中M1型巨噬细胞有助于斑块生长和不稳定，导致持续炎症反应；相反，M2型巨噬细胞够减小斑块并增强斑块稳定性，在AS进展中具有预防作用［13］。有研究人员对12周和16周的AS斑块进行了分析，发现早期和晚期AS斑块中均存在M1和M2型巨噬细胞。随着AS发展，M2型巨噬细胞数量减少，而稳定斑块中M2型巨噬细胞比例相对较高。M2型巨噬细胞可促进抗炎细胞因子IL-10和TGF-β 等表达［14］。M1型巨噬细胞在不稳定斑块中占主导地位，能够促进促炎细胞因子等分泌。

本研究用PMA诱导THP-1巨噬细胞极化，而后分别用LPS和IFN-γ、IL-4和IL-13诱导得到M1和M2型巨噬细胞，制备条件培养基进行后续实验，结果显示，巨噬细胞M1型极化能够抑制血管平滑肌细胞增殖并促进其凋亡，而巨噬细胞M2型极化能够促进细胞增殖并抑制其凋亡，提示巨噬细胞极化对AS发生发展有一定影响，与既往研究结果一致［15］。此外，巨噬细胞M1型极化能够促进促炎细胞因子IL-1α和IL-6表达，抑制抗炎细胞因子TGF-β表达，巨噬细胞M2型极化则相反，与LUO等［16］研究结果一致，提示巨噬细胞极化能够通过调控炎症因子表达影响炎症反应，进而参与AS发生和发展。研究表明，PI3K/Akt/mTOR信号通路在AS炎症中发挥关键调控作用［17-18］。ZHANG等［19］发现抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路可促进巨噬细胞M2型极化和自噬，减少炎症因子含量，发挥AS保护作用。SHAO等［20］发现抑制PI3K/Akt/mTOR通路能够促进巨噬细胞自噬，促进AS斑块中巨噬细胞M2型极化，减少AS斑块面积。本研究显示，巨噬细胞M1型极化能够促进血管平滑肌细胞中PI3K/Akt/mTOR通路激活，而巨噬细胞M2型极化则抑制PI3K/Akt/mTOR通路激活，表明巨噬细胞极化对PI3K/Akt/mTOR信号通路具有调控作用，即巨噬细胞极化能够通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路参与AS炎症反应。

综上，巨噬细胞极化能够通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路激活调节炎症细胞因子表达，参与AS炎症反应。

参考文献:

[3]黄达民,张金春,宋蕾,等.红参调控DARS-AS1/miR-125a5p通路对人血管平滑肌细胞生物学过程的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2022,20(23):4282-4287. DOI:10. 12102/j. issn. 1672-1349. 2022. 23. 009.[

[5]于红红,李芳,罗瑞熙,等.四妙勇安汤含药血清对LPS诱导的M1/M2巨噬细胞极化及NF-κB/NLRP3通路的影响[J].免疫学杂志,2023,39(4):320-325.

[6]朱玉娇,马蕾,薛海波. NOTCH1信号通路调控PI3K/AKT/mTOR信号通路的研究进展[J].中国免疫学杂志,2020,36(21):2667-2671.

基金资助:武汉市卫健委青年基金(WX21Q11);

文章来源:冯莹,张妍,雷杰,等.巨噬细胞极化对血管平滑肌细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响[J].中国免疫学杂志,2025,41(02):315-319.