首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 内科论文 > 动脉粥样硬化论文 > miR-155通过调控CaSR表达影响VSMC生长的机制研究

miR-155通过调控CaSR表达影响VSMC生长的机制研究

2021-03-04 201 上传者：管理员

摘要：目的miR-155可以通过干扰血管平滑肌细胞(VMSC)生物活性来抑制动脉粥样硬化斑块的形成,但具体机制不十分清楚。本研究主要观察miR-155对VSMC中钙敏感受体(CaSR)表达的影响,同时探讨CaSR在miR-155调控VSMC生物活性过程中的作用。方法培养VSMC,将miR-155mimic、Ad-CaSR转染到VSMC中,Westernblot检测相关基因的表达,MTT测定VSMC生长情况,流式细胞术检测VSMC的凋亡情况,Transwell检测VSMC迁移情况。结果miR-155mimic组CaSR的表达水平明显受抑制,VSMC凋亡明显减少,而VSMC的增殖和迁移能力明显增强;Ad-CaSR组和miR-155+Ad-CaSR组VSMC凋亡明显增加,而VSMC的增殖和迁移能力明显下降。结论miR-155可以调控VSMC的生长,该作用可能是通过影响VSMC中CaSR的活性得以实现。

关键词：
miR-155
动脉粥样硬化
流式细胞术检测
血管平滑肌细胞
钙敏感受体
加入收藏

miR-155是microRNA家族中的重要成员之一。miR-155可以通过多种方式参与细胞生长发育过程的调节。miR-155可以通过发挥类激素样作用来影响血管重塑和动脉粥样硬化斑块的形成[1,2]。研究已经证实,miR-155在动脉血管中存在高表达,且miR-155主要来源于血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VSMC)[3,4]。当降低miR-155的表达时,受损血管内膜增生减少,动脉粥样硬化斑块形成减慢。虽然上述研究表明miR-155在VSMC增殖引起的动脉粥样硬化斑块形成过程中起到重要作用,但机制仍不十分清楚。

钙敏感受体(calciumsensingreceptor,CaSR)在人体各大组织器官中均有表达。近年来研究发现,在巨噬细胞中也存在CaSR的表达,当增强CaSR的表达时IP3的分泌明显增加,生成的IP3又能促进Ca2+释放,使细胞内的Ca2+浓度升高,抑制泡沫细胞生成,进而延缓动脉粥样硬化斑块的发展[5,6]。但CaSR影响动脉粥样硬化斑块形成的具体机制尚不十分清楚。

本研究主要探讨miR-155是否通过干扰VSMC内CaSR的活性来影响VSMC增殖和凋亡及其相关机制,进而为动脉粥样硬化斑块的防治提供新靶点和新思路。

1、材料和方法

1.1材料

miR-155激动剂(上海生物科技有限公司);鼠抗人CaSR抗体、兔抗人PI3K抗体、小鼠抗β-actin抗体、山羊抗鼠IgG(中杉金桥生物技术有限公司);MTT(欣博盛生物科技有限公司);AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒(Abcam公司);ECL发光试剂盒、BCA蛋白含量检测试剂盒(凯基生物科技发展有限公司)。

1.2VSMC的培养

取7～8周龄雄性SD大鼠的胸主动脉,PBS清洗2～3次,剥离内膜、外膜,剪成1mm×1mm大小的组织块,置于培养瓶内,加入含20%胎牛血清的DMEM培养液,置于37℃、5%CO2培养箱中孵育。3～5天换液1次,0.25%胰蛋白酶消化传代,用含10%FBS的DMEM培养液培养。

1.3转染实验

miR-155mimic、Ad-CaSR在37℃下转染VSMC24h。将VSMC接种于6孔板中,培养至50%汇合,用5mLLipofectamine2000转染,于10%胎牛血清中培养24h。然后换含有100kU/L青霉素和100μg/L链霉素的新培养基。

1.4细胞增殖的测定

胰酶消化细胞,制成细胞悬液,接种于96孔板,随机分组,每组设4～6个平行孔。培养箱中培养,然后用40nmol/LmiR-155mimic或Ad-CaSR构建体转染,并孵育48h,向各孔中加入MTT溶液,培养4h后吸弃孔内培养液,每孔加入DMSO150μL,37℃温箱孵育15min后震荡混匀,用酶联免疫检测仪测定光密度值(OD值,检测波长570nm)。

1.5Transwell检测VSMC的迁移能力

在Transwell上室中加入40mLMatrigel稀释液,37℃孵育12h。各组细胞用含0.1%BSA的无血清培养基重悬,使细胞数为2×105个/mL。取100μL细胞加入上室,500μL含10%血清培养基加入下室,每组设3个复孔,培养48h,取出小室,小室以甲醇固定15min,PBS洗3次,每次5min;结晶紫染色15min,PBS洗3次,每次5min。镜下观察,每个滤膜随机取5个视野(100×),取均值计数,并照相分析。

1.6AnnexinⅤ-FITC/PI检测VSMC凋亡

培养48h后收集细胞,调细胞数至1×106,以PBS洗2次,用1×BindingBuffer重悬,每组分别取100μL移至新管,加入5μLAnnexinⅤ-FITC及5μLPI,振荡后于室温下避光静置15min,每管加入400μL1×BindingBuffer,染色后上流式细胞仪检测。

1.7Westernblot检测VSMC相关蛋白表达

收集细胞,PBS洗2次,提取细胞总蛋白。每孔40μg含量加样,电泳分离。转至PVDF膜上,37℃封闭2h。分别与1∶300鼠抗人CaSR、1∶600兔抗人PI3K抗体4℃孵育过夜。TBST洗膜3次,每次10min,加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(1∶500),4℃孵育2h。洗膜3次,每次10min。ECL发光试剂盒发光显影,凝胶成像。

1.8统计学方法

采用SPSS13.0forwindows统计软件进行处理。数据以x¯±s表示,各组数据进行正态性和方差齐性检验,样本的均数比较采用方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1miR-155mimic和/或Ad-CaSR对VSMC内CaSR表达的影响

Westernblot检测结果显示,miR-155mimic组VSMC内CaSR的表达明显受抑制(P<0.05),miR-155mimic+Ad-CaSR组和Ad-CaSR组VSMC内CaSR的表达则明显增强(P<0.05),而miR-155mimic+Ad-CaSR组与Ad-CaSR组VSMC内CaSR的表达无明显差异(图1)。

图1.Westernblot检测VSMC内CaSR的表达

2.2miR-155mimic和/或Ad-CaSR对VSMC增殖能力的影响

MTT检测结果显示,miR-155mimic组VSMC的增殖能力明显提高(P<0.05),miR-155mimic+Ad-CaSR组和Ad-CaSR组VSMC的增殖能力则明显受抑制(P<0.05),miR-155mimic+Ad-CaSR组与Ad-CaSR组VSMC的增殖能力无明显差异。该结果说明高表达的miR-155可以促进VSMC增殖,但CaSR的表达增强时,miR-155促进VSMC增殖的作用明显受抑制(图2)。

图2.MTT实验观察各组VSMC增殖情况

2.3miR-155mimic和/或Ad-CaSR对VSMC凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示,miR-155mimic组VSMC凋亡明显减少(P<0.05),miR-155mimic+Ad-CaSR组和Ad-CaSR组VSMC凋亡则明显增加(P<0.05),而miR-155mimic+Ad-CaSR组与Ad-CaSR组VSMC凋亡无明显差异。该结果说明高表达的miR-155可以抑制VSMC凋亡,但CaSR表达增强时,miR-155抑制VSMC凋亡的作用明显降低(图3)。

图3.流式细胞术观察各组VSMC凋亡情况

2.4miR-155mimic和/或Ad-CaSR对VSMC迁移能力的影响

Transwell检测结果显示,miR-155mimic组VSMC的迁移能力明显增强(P<0.05),miR-155mimic+Ad-CaSR组和Ad-CaSR组VSMC的迁移能力则明显减弱(P<0.05),而miR-155mimic+Ad-CaSR组与Ad-CaSR组VSMC的迁移能力无明显差异。该结果说明高表达的miR-155可以促进VSMC的迁移能力,但CaSR的表达增强时,miR-155促进VSMC迁移的作用明显降低(图4)。

图4.Transwell实验观察各组VSMC的迁移情况

2.5miR-155mimic和/或Ad-CaSR对VSMC内PI3K蛋白表达的影响

作用VSMC48h后,过表达miR-155显著增强VSMC内PI3K的表达(P<0.05),而增强miR-155表达同时增强CaSR表达时,VSMC内PI3K表达的能力被抑制(P<0.05)。表明miR-155可能是通过干扰VSMC内CaSR活性来影响PI3K基因的表达(图5)。

图5.Westernblot检测各组VSMC内PI3K的表达

3、讨论

CaSR参与人体动脉粥样硬化斑块形成和血管重塑等病理性疾病的发生、发展,它主要是通过Ca2+/CaSR信号通路对上述病理过程进行相应的调节[7,8,9]7-9]。miR-155在心血管疾病发生、发展过程中也起到了十分重要的作用,miR-155可以促进VSMC增殖、迁移及血管形成[10,11]10-11]。

本研究在VSMC内转染miR-155mimic,观察miR-155mimic对VSMC内CaSR表达的影响,结果发现,过表达的miR-155可以明显抑制VSMC内CaSR的表达,但当CaSR的表达增强时miR-155抑制CaSR表达的作用明显减弱。该结果初步证实,过表达的miR-155可以降低VSMC内CaSR的表达。在转染miR-155mimic的VSMC中发现细胞的增殖能力和迁移能力明显增强,同时细胞的凋亡能力明显下降,而单独转染Ad-CaSR和联合转染miR-155mimic+Ad-CaSR的VSMC的生物学活性均出现相反的结果,该研究结果证实高表达的miR-155可以促进VSMC增殖和迁移,同时抑制细胞凋亡,但当增强CaSR的表达时,miR-155的上述作用明显受抑制。

上述研究结果不但证实miR-155与CaSR在调节VSMC生物学活性过程中起到十分重要的作用,同时还提示miR-155的这种调控作用很可能是通过调节CaSR的活性来得以实现的。

PI3K/Akt是人体生命活动中十分重要的信号通路。PI3K/Akt可以通过调节下游一系列底物的表达来影响细胞的生物活性。研究发现,PI3K/Akt信号通路在VSMC中存在广泛表达,是调节VSMC生物学活性的重要信号通路[12,13]12-13]。

本研究结果发现,miR-155能明显促进PI3K的表达,但当CaSR表达增强时miR-155促进PI3K表达的作用被明显降低。该研究结果说明,过表达的miR-155可能是通过抑制CaSR表达来增强PI3K的活性,进而影响VSMC的生物学活性,但miR-155又是通过何种途径对VSMC内CaSR进行调控还不得而知。

综上,根据本研究结果可得出,miR-155可能是通过调节CaSR表达来影响VSMC活性,最终干扰动脉粥样硬化斑块的形成。本研究不仅阐述了miR-155调控VSMC内CaSR表达的作用机制,而且为动脉粥样硬化斑块的防治提供了新靶点。

金子函,张家宁,冯璐,张凤香.miR-155通过调控CaSR表达影响VSMC生长的机制研究[J].中国动脉硬化杂志,2021,29(03):201-205.

基金:辽宁省自然科学基金项目(20180550601､2019-ZD-0833､201910160065)