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miR-34a通过调控Sirt1/FoxO1通路影响血管内皮细胞凋亡

2021-03-04 466 上传者：管理员

摘要：目的探讨microRNA-34a(miR-34a)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人主动脉内皮细胞(HAEC)凋亡的影响及作用机制。方法ox-LDL处理HAEC,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-34a的表达水平。AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪(FCM)和Caspase-3活性检测试剂盒检测细胞凋亡率。使用Targetscan等生物信息学软件预测miR-34a的潜在靶基因,双荧光素酶报告基因实验验证miR-34a与Sirt1mRNA3′UTR直接靶向结合。结果在ox-LDL诱导HAEC凋亡过程中miR-34a表达逐渐增加。过表达miR-34a促进HAEC凋亡,而抑制miR-34a的表达水平可以部分程度缓解ox-LDL诱导的HAEC凋亡。进一步机制研究发现,Sirt1为miR-34a的下游靶基因,沉默Sirt1基因逆转了miR-34a抑制物(miR-34ainhibitor)的抗凋亡作用。miR-34a过表达可以使乙酰化FoxO1的蛋白表达明显增加,而miR-34a的表达下调可以使乙酰化FoxO1的蛋白表达明显降低。结论下调miR-34a对ox-LDL诱导的HAEC凋亡具有抑制作用,且该作用可能与活化Sirt1/FoxO1通路有关。

关键词：
microRNA-34a
SIRT1
人主动脉内皮细胞
动脉粥样硬化
细胞凋亡
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动脉粥样硬化(As)是累及大中动脉的慢性炎症性病变,是目前全球范围内致死的重要病因。As的启动因素为血管内皮细胞(EC)功能障碍[1]。氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)是导致As的最重要危险因素之一,能够促进EC损伤、促进单核细胞的黏附、促进血管平滑肌细胞增殖和迁移、促进泡沫细胞和血栓的形成[2]。因此,抑制ox-LDL诱导的EC凋亡对动脉粥样硬化性疾病的预防和治疗有重要意义。microRNA(miRNA)是一种长度为21～23个核苷酸的内源性非编码RNA,研究显示miRNA通过与靶mRNA3′UTR区的不完美配对,在转录后水平上负向调控靶基因的表达,从而广泛参与包括细胞存活和凋亡在内的多种生理和病理过程[3]。近年来miR-34a被报道在EC衰老、慢性缺氧、血管新生等多种生理和病理过程中发挥重要作用[4]。本研究通过建立ox-LDL诱导的人主动脉内皮细胞(humanaorticendothelialcell,HAEC)凋亡模型,探讨miR-34a对ox-LDL诱导的HAEC凋亡的影响及机制,为动脉粥样硬化性疾病的防治提供一定的理论基础。

1、材料和方法

1.1主要材料

HAEC、内皮细胞培养基、内皮细胞生长因子购自美国ScienCell公司;胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)、OPTI-MEMI培养基、总RNA提取试剂TRIzol、转染试剂Lipofectamine2000购自美国英杰生命技术有限公司;ox-LDL购自北京协生生物有限公司;miRNA模拟物对照(NCmimic)、miR-34a模拟物(miR-34amimic)、miRNA抑制物对照(NCinhibitor)、miR-34a抑制物(miR-34ainhibitor)、Sirt1特异性siRNA和干扰对照siRNA(NCsiRNA)购自广州锐博生物科技有限公司;Caspase-3活性检测试剂盒、CCK-8检测试剂盒、AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自江苏碧云天生物科技有限公司;四甲基偶氮唑盐(methylthiazolyltetrazolium,MTT)购自美国AMRESCO公司;TaqManMicroRNAassays购自美国应用生物系统公司;实时荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司;PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成;Westernblot中所用Sirt1、FoxO1、乙酰化FoxO1和β-actin一抗购自美国Abcam公司;山羊抗兔IgG二抗购自美国KPL公司;pMIR-REPORT荧光素酶报告载体购自美国Ambion公司。

1.2细胞培养

HAEC培养于含10%FBS和1%青霉素+1%链霉素的内皮细胞培养基中,培养条件为37℃、5%CO2培养箱内培养,待细胞长至80%融合度进行后续实验。

1.3细胞转染和细胞处理

按照说明书分别将50nmol/LmiR-34amimic,miR-34ainhibitor,5μgpcDNA-Sirt1和pc-DNA-FoxO1转染至HAEC,阴性对照组为NCmimic、NCinhibitor和pcDNA-NC,之后再经或不经ox-LDL(100mg/L)作用24h。救援实验:HAEC中分别共转染miR-34ainhibitor和50nmol/LSirt1特异性siRNA或NCsiRNA,之后再经ox-LDL(100mg/L)作用24h。

1.4Caspase-3活性检测和流式细胞仪检测细胞凋亡

首先将待检测的各组细胞调整为5×103个/μL,离心弃掉上清液,使用PBS洗涤2次,加入100μL裂解缓冲液,冰上放置15min,涡旋振荡15s,离心5min。取10μL蛋白上清液,加入到90μLCaspase-3活性检测液,加入10μLac-LEHD-pNA,避光反应1～2h后检测结果。

将HAEC悬液以1×106个/mL接种至6孔板,将经不同处理后的HAEC收集,并按照说明书用AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒进行染色,流式细胞仪检测HAEC的凋亡率。AnnexinV-FITC(+)PI(-)细胞为早期凋亡细胞,凋亡率=早期凋亡细胞数/所检测细胞总数×100%。

1.5细胞活力测定

HAEC接种至96孔板,不同处理组设置5个重复孔,待细胞长至待检测时间点,加入MTT10μL,继续培养4h,每孔加入DMSO溶解结晶,酶标仪490nm波长处测定吸光度值。

1.6细胞增殖检测

HAEC接种于96孔板,每孔100μL,细胞培养箱中继续培养1天后,每孔加入CCK-8溶液10μL,孵育2h后酶标仪在450nm波长处测量吸光度值。

1.7qRT-PCR检测miR-34a和Sirt1mRNA的表达

TRIzol提取总RNA,采用分光光度法在260nm处测定RNA水平,通过反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒分别将RNA合成cDNA,并配制反应体系,进行扩增,以U6和GAPDH为内参。反应条件为:94℃变性2min;然后94℃30min→58℃30s→72℃30s进行循环扩增,共45个循环,最后72℃延伸2min。miR-34a上游引物5′-CGGTATCATTTGGCAGTGTCT-3′,下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;Sirt1上游引物5′-TAGCCTTGTCAGATAAGGAAGGA-3′,下游引物5′-ACAGCTTCACAGTCAACTTTGT-3′;U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;GAPDH上游引物5′-TCCCTCAAGATTGCTAGCAA-3′,下游引物5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′。

1.8Westernblot检测

提取各组细胞样本总蛋白,定量,与上样缓冲液按比例混匀,100℃5min,8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后电转移至聚偏二氟乙烯膜上,5%脱脂牛奶封闭2h,加入含有Sirt1多克隆抗体(1∶2000),4℃孵育过夜,TBST缓冲液洗涤3次,每10min换液1次。加入辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG(1∶2000),37℃孵育45min,TBST缓冲液洗涤3次,每15min换液1次,在暗室中压片,然后显影、定影。

1.9荧光素酶报告基因检测

生物信息学预测显示miR-34a与Sirt1的3′UTR存在结合位点,将含有结合位点与突变位点的Sirt1-3′UTR片段分别插入荧光素酶报告基因载体构建野生型载体pMIR-Sirt1-3′UTR(pMIR-Sirt1-3′UTR-WT)与突变型载体pMIR-Sirt1-3′UTR(pMIR-Sirt1-3′UTR-Mut),取生长状态良好的HAEC,分别将pMIR-Sirt1-3′UTR-WT、pMIR-Sirt1-3′UTRMut与NCmimic、miR-34amimic共转染并置于细胞培养箱内继续培养48h,检测各组细胞荧光素酶活性。

1.10统计学分析

采用SPSS软件进行统计学处理。计量资料用x¯±s表示,多组间参数比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA),两组间参数比较采用t检验,P<0.05判定差异有统计学意义。

2、结果

2.1ox-LDL诱导HAEC凋亡过程中miR-34a表达上调

ox-LDL(100mg/L)作用于HAEC不同的时间(0～24h)后,采用Caspase-3活性测定和流式细胞仪分析细胞凋亡情况,结果显示ox-LDL呈时间依赖性的诱导HAEC发生凋亡(图1A～1C)。HAEC活力明显降低(图1D)。qRT-PCR法检测此过程中miR-34a的表达水平变化,结果显示随着HAEC凋亡率的增加,miR-34a的表达逐渐上调,与0h组相比差异有统计学意义(图1E)。

图1.ox-LDL对HAEC凋亡和miR-34a表达的影响

2.2Sirt1是miR-34a在EC中的靶基因之一

利用生物信息学软件(Targetscan、miRanda和MIRDB)预测miR-34a可能的靶基因,挑选Sirt1作为下一步的研究对象。如图2所示,Sirt1的3′UTR含有miR-34a的结合位点。为研究miR-34a对Sirt1蛋白和mRNA表达的影响,miR-34amimic和miR-34ainhibitor被转染入HAEC。ox-LDL处理后可使Sirt1蛋白的表达明显下调,与miR-34a的表达负相关。miR-34a过表达可以显著抑制Sirt1蛋白的表达,而miR-34ainhibitor促进Sirt1蛋白的表达(图2)。此外,miR-34amimic和miR-34ainhibitor的转染对Sirt1mRNA的表达无明显影响(图2)。

为进一步验证miR-34a是否与Sirt1mRNA3′UTR直接结合,采用荧光素酶报告基因实验进行鉴定。结果显示,与NCmimic组相比,miR-34amimic与pMIR-Sirt1-3′UTR-WT共同转染后荧光素酶活性显著降低,而miR-34amimic和pMIR-Sirt1-3′UTR-Mut共转染组的荧光素酶活性则无显著差异(图2)。说明miR-34a可以通过与Sirt13′UTR上的预测靶位点结合直接抑制基因的表达,而当预测的靶位点发生突变后,miR-34a对下游靶基因的抑制作用基本消除。因此,在HAEC中Sirt1是miR-34a的直接靶基因。

图2.Sirt1是miR-34a在EC中的靶基因

2.3下调miR-34a抑制EC凋亡

与NCmimic组相比,miR-34amimic可以促进ox-LDL诱导的HAEC凋亡,相反,抑制miR-34a后可以保护EC免受ox-LDL诱导的凋亡。此外,在本次实验中ox-LDL作用后抑制了HAEC的存活和增殖,过表达miR-34a使HAEC的存活和增殖率进一步降低,而抑制miR-34a可以促进EC的存活和增殖(图3)。

图3.miR-34a对ox-LDL诱导的EC凋亡的影响

2.4miR-34a通过靶向Sirt1调节EC凋亡

转染miR-34ainhibitor上调了Sirt1蛋白的表达,而miR-34ainhibitor与si-Sirt1共转染导致Sirt1蛋白表达水平显著下降(图4A)。Caspase-3活性检测和流式细胞仪凋亡检测显示miR-34ainhibitor抑制ox-LDL诱导的EC凋亡,而当si-Sirt1抑制Sirt1蛋白的表达后miR-34ainhibitor的内皮保护作用也相应被抑制(图4B-D)。以上救援实验结果表明,miR-34a通过靶向Sirt1基因调控EC凋亡。

图4.miR-34a通过直接靶向Sirt1调控EC凋亡

2.5miR-34a影响乙酰化FoxO1蛋白的表达

ox-LDL作用24h增加了EC中乙酰化FoxO1的蛋白表达。但抑制miR-34a的表达部分程度上逆转了这种趋势。相反的,miR-34amimic可上调乙酰化FoxO1的蛋白表达(图5A)。在HAEC中转染Sirt1表达载体使Sirt1过表达后可以抑制乙酰化的FoxO1蛋白表达(图5B),而转染FoxO1表达载体后对Sirt1的蛋白表达无显著影响(图5C)。

图5.miR-34a调控Sirt1/FoxO1通路

3、讨论

新近研究表明,miRNA广泛参与了EC增殖、迁移、损伤、炎症和衰老等众多病理生理过程[5]。此外,越来越多研究证实在As背景下,有很多差异表达的miRNA在调控EC存活和死亡方面扮演重要角色[6]。鉴定凋亡相关miRNA并分析其靶点的功能,可为调节EC功能和心血管疾病的病理机制提供新的见解。本研究结果显示miR-34a通过直接靶向Sirt1从而发挥调控EC凋亡的作用。

miR-34a已被证实在多种心血管疾病和EC功能障碍中发挥调控作用[7]。miR-34a在As斑块[8]、冠心病[9]和高血压[10]患者外周血中表达增加。miR-34a通过促进血管细胞黏附分子1(vascularadhesionmolecule-1,VCAM-1)、细胞间黏附分子1(intercellularadhesionmolecule-1,ICAM-1)和IL-6的表达而调控EC炎症[11]。miR-34a可以激活NF-κB信号通路而参与震荡剪切力(oscillatingshearstress,OSS)诱导的EC炎症反应[12]。miR-34a可促进高糖诱导的视网膜微血管内皮细胞衰老线粒体功能障碍[13]。经慢性间歇性缺氧刺激后,EC中miR-34a表达上调,通过Bcl-2/Beclin1信号转导通路诱导自噬[14]。转染miR-34a抑制下游Notch1基因,从而缓解VEGF诱导的视网膜内皮血管新生[15]。本研究中发现miR-34a在ox-LDL诱导HAEC凋亡过程中表达明显上调。过表达miR-34a促进了HAEC凋亡,而抑制miR-34a可以抗凋亡,发挥内皮保护作用。

沉默信息调节因子2相关酶1(Sirt1)是NAD+依赖性蛋白脱乙酰酶,在抑制凋亡、抗氧化应激以及延缓细胞衰老等方面起重要作用。FoxO1为O-box子家族中叉头转录因子的成员,其活性受乙酰化、磷酸化和泛素化调节。Sirt1具有去乙酰化的作用,在细胞核内,Sirt1可以使FoxO1发生去乙酰化,一方面刺激细胞周期蛋白P27KIP1的表达,P27KIP1蛋白使细胞周期阻滞在G0和G1期,有利于氧自由基清除和损伤DNA的修复;另一方面,抑制促凋亡蛋白BIM、FasL等的表达,减少细胞凋亡[16,17]。本研究中发现ox-LDL刺激HAEC后Sirt1的表达减少、乙酰化FoxO1的表达增多。miR-34amimic干预后Sirt1的表达下调而乙酰化FoxO1的蛋白表达增加。相反地,抑制miR-34a表达可以促进Sirt1蛋白的表达水平并降低乙酰化FoxO1的蛋白表达。进一步荧光素酶报告基因实验证实Sirt1是miR-34a的直接靶基因之一。沉默Sirt1之后miR-34ainhibitor的内皮保护作用也相应抑制,说明miR-34a调控EC凋亡的作用可能与Sirt1/FoxO1途径有关。

综上所述,抑制miR-34a可以通过激活Sirt1/FoxO1通路而缓解EC凋亡。本研究为防治内皮细胞功能障碍和As提供新的治疗靶点和思路。

肖丽,刘萍,秦冰.miR-34a通过调控Sirt1/FoxO1通路影响血管内皮细胞凋亡[J].中国动脉硬化杂志,2021,29(03):193-200.

基金:国家自然科学基金项目(81701167);广东省自然科学基金项目(2017A030310360)